PONTILLE Laura
VELUD LoicGROUPE : A2
TP BIOLOGIE MOLECULAIRE 1 2014-2015
SEPARATION D’ADN PAR ELECTROPHORESE ANALYTIQUE ET PREPARATIVE

OBJECTIF.
Le but de ce TP est de purifier l’ADN plasmidique de pUC18-wzc ; d’en établir sa carte de restriction et de calculer le rendement de l’extraction du gène wzc. Pour cela, on fera agir différentes enzymes de restriction sur cet ADN plasmidique puis on réalisera une migration sur gel d’agarose. Pour finir, nous déterminerons la quantité de gène wzc que l’on aura extrait de ce gel.
Principe.
1-Préparation de l’ADN plasmidique Puc18-wzc.
Dans cette étape, nous cherchons à extraire le plasmide pUC18-wcz de la bactérie E.Coli le contenant. Pour cela, nous allons décrire la technique utilisée.
Tout d’abord , nous utilisons la solution I permettant de lyser les structures cellulaires et éliminer les grosses molécules. On obtient un lysat. L’EDTA présent dans cette solution va permettre de protéger l’ADN d’intérêt contre la dégradation par les nucléases présentes en les rendant inactives, étant donné que ce composé est un chélateur de Mg 2+ et que le bon fonctionnement des nucléases nécessite des ions Mg2+.
Ensuite nous mettons la solution 2 contenant le SDS et la soude (NaOH). Le SDS est un détergent qui dissous et dégrade les composants lipidiques de la membrane bactérienne, libérant ADN et protéines dans la solution. La soude elle va permettre de dénaturer l’ADN plasmidique ou génomique.
Nous utiliserons alors la solution 3 contenant de l’acide acétique 2M qui va permettre de neutraliser la soude de la solution 2.La neutralisation du pH du milieu permettra à l’ADN plasmidique de se réhybrider plus facilement. L’acétate de potassium lui va permettre de précipiter les protéines et l’ADN chromosomique.
Le phénol ajouté au surnageant (qui contient notre ADN d’interêt) élimine les protéines dans le milieu. De plus, le chloroforme lui va permettre aux protéines restantes dans la phase aqueuse (avec l’ADN plasmidique