Altaïr, membre de la confrérie secrète des Assassins au XIIe siècle, doit exécuter neuf hommes dispersés entre les villes de Damas, Acre et Jérusalem afin de retrouver son statut de maître Assassin qu'il vient de perdre. Après chaque assassinat, Altaïr retrouve une partie de l'équipement et des capacités dont il avait été privé suite à sa destitution, lui permettant ainsi de poursuivre ses missions. Le jeune homme exécute ses cibles, sur ordre de son maître Al-Mualim dans le but de ramener la paix dans sa patrie natale. Ces « hommes à abattre » sont des personnages influents au sein de leurs villes respectives, à différents niveaux. Altaïr apprend au cours du jeu qu'ils font également tous partie de l'Ordre du Temple. Ces assassinats font suite au vol de l'Orbe d'Eden par la Fraternité des Assassins, qui l'avait reprise aux Templiers, eux-mêmes l'ayant déjà dérobé aux assassins. Cet artefact aurait des pouvoirs divins, selon Al Mualim. Entre autres miracles, il aurait ouvert la Mer Rouge en deux et été la cause de la guerre de Troie. Il aurait également été utilisé par le Christ pour changer l'eau en vin, et pourrait permettre à son possesseur de contrôler les esprits, et donc les hommes.

Au cours de l'aventure, on découvre qu'Abstergo est en réalité une multinationale qui réunit les Templiers du monde moderne et qui cherche à changer le monde. Elle est à la recherche d'objets ayant des pouvoirs semblables à ceux de l'Orbe d'Eden, et projettent de les envoyer en orbite autour de la Terre à l'aide de satellites pour contrôler la totalité de la population mondiale. Abstergo est prête à tout pour arriver à ses fins, et n'hésite pas à commettre des enlèvements, des catastrophes écologiques, ou des meurtres.

Altaïr exécute les ordres, en se posant tout de même quelques questions, mais désireux de retrouver son honneur. À la fin des souvenirs accessibles à Desmond, le jeune Assassin de Masyaf se rend compte qu'il avait été victime de manipulation de son maître