Audubon est né aux Cayes, à Haïti, fils illégitime d'une immigrée française1 et d'un capitaine au long cours d'origine bretonne et protestante, Jean Audubon, qui possédait dans l'île des plantations et des esclaves. Il se passionne très jeune pour l'histoire naturelle. Il est élevé en France, à Nantes et non loin de là à Couëron, par sa belle-mère, Anne Moynet Audubon. Il a prétendu avoir reçu des leçons du peintre David mais, comme beaucoup d'autres « histoires » d'Audubon, cette affirmation est infondée.
En 1803, son père lui obtient un faux passeport qui lui permet de se rendre aux États-Unis et échapper ainsi à la conscription en vigueur en cette période de guerres napoléoniennes. Pendant le voyage, il contracte la fièvre jaune. Le capitaine du bateau le débarque alors dans une pension dirigée par des femmes quakers qui le soignent, le guérissent, et lui enseignent l'anglais particulier des quakers.
Il devient contremaître dans une ferme près de Philadelphie et commence à étudier l'histoire naturelle en dirigeant la première opération de baguage du continent. Il noue un fil à la patte d'une moucherolle (Sayornis phoebe) et remarque ainsi que ces oiseaux reviennent nicher chaque année aux mêmes endroits. Il commence également à dessiner et à peindre des oiseaux.
Il a trois enfants de son union avec Lucy Bakewell — Victor, John et une petite fille qui décédera avant son premier anniversaire.
Après plusieurs années de succès commerciaux en Pennsylvanie et dans le Kentucky, il fait faillite, ce qui l'incite à poursuivre avec plus d'ardeur son étude de la nature et sa pratique de la peinture. Il descend le Mississippi avec son fusil, sa boîte de couleurs et son assistant, dans l'intention de trouver et de peindre toutes les espèces d'oiseaux d'Amérique du Nord. Il mène à partir de 1810 une vie errante de chasseur, tout en observant la nature avec amour et en décrivant et en illustrant la flore et la faune, en particulier les oiseaux, avec grand talent.