Biochimie

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  • Publié le : 4 avril 2011
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DIAPOSITIVE 1
Bonjour, je m’appelle xxx, je suis étudiante en Licence Professionnelle Biologie Analytique et Expérimentale. Aujourd’hui, je vais vous exposer le travail que j’ai réalisé durant mon stage de fin d’étude. Ma mission a été la purification et la caractérisation d’une enzyme appelée SuperOxyde Dismutase.

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Je vais commencer par vous préciser mon objectif et lesconditions dans lesquelles j’ai effectué mon stage. Puis je vais vous présenter brièvement les Espèces Activées de l’Oxygène et les Superoxydes dismutases. Ensuite je vous expliquerai les démarches que j’ai effectuées pour atteindre mon objectif. Enfin je vous ferai un bilan scientifique et professionnel sur cette expérience.

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Mon objectif durant ce stage a été d’établir un protocolepermettant de produire de la Superoxyde Dismutase pure et en grande quantité à partir de sang de porc. Pour cela je disposais de 14 semaines de stage initial, du 20 février au 26 mai 2006. A ma demande et en accord avec l’IUT et le CEA, ce stage est prolongé jusqu’au 30 juin 2006. Ce travail a été réalisé au laboratoire de Radiolyse du centre CEA de Saclay. J’y ai occupé un véritable rôle detechnicienne de laboratoire de Recherche en Biologie.

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Pour situer mon sujet, je vais dire quelques mots sur les Espèces Activées de l’Oxygène et les superoxydes dismutases.
L'oxygène est indispensable aux organismes vivants mais il peut devenir toxique car il contribue à la formation de produits très réactifs, par exemple, l'oxygène singulet. Ces EAO réagissent avec les macromoléculesbiologiques (ADN, protéines, lipides) présentes dans leur environnement et provoquent des dommages biologiques graves.
Pour prévenir leurs effets néfastes, les organismes sont dotés d'enzymes antioxydantes. Ainsi, les superoxydes dismutases éliminent spécifiquement le radical superoxyde pour générer du peroxyde d'hydrogène. Il existe deux grandes familles qui se différencient par leur absenced'homologie structurale : la famille des superoxydes dismutases à fer ou à manganèse et la famille des superoxydes dismutases à cuivre et zinc qui fait l’objet de mon étude.

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La SOD Cu/Zn a été découverte la première fois dans le sang de bœuf. Elle se situe dans les hématies. C’est une protéine bleu-vert de 31 kDa composée de deux sous-unités identiques formant huit brins bêtaantiparallèles et trois grandes boucles externes.

DIAPOSITIVE 6 : Protocole de purification
Pour purifier cette enzyme, il m’a fallu établir un protocole à partir des articles déjà publiés sur ce sujet. Il faut commencer par obtenir du sang de porc qui est lavé avec une solution physiologique. Ainsi il est possible de ne récupérer que les hématies auxquelles est ajouté de l’eau distillée pour obtenirl’hémolysat. Un traitement au chloroforme et éthanol est alors effectué. Le surnageant est récupéré et traité par du phosphate de potassium dibasique. Le dernier traitement par de l’acétone permet de récupérer la SOD. Pour finir, la solution protéique est dialysée.

DIAPOSITIVE 7 : Etape 1 Extrait
Les démarches ont été nombreuses et difficiles pour obtenir le droit d’utiliser du sang de porc.Il a fallu se référer au règlement du parlement européen et du conseil du 3 Octobre 2002, qui établit les règles sanitaires applicables aux sous-produits animaux non destinés à la consommation humaine. Le sang est conservé par une solution anticoagulante composée d’acide citrique, de citrate de sodium et de dextrose.
Après centrifugation, les hématies sont compactées dans le culot globulaire. Leslipides forment une couche blanchâtre à l’interface entre le culot globulaire et le plasma surnageant. Le plasma et les lipides sont éliminés par aspiration à l’aide d’une pompe à eau.

DIAPOSITIVE 8 : Etape 2 Lavage au NaCl
Pour cette étape, j’ai utilisé une solution isotonique de NaCl 9‰.
Le culot globulaire est suspendu dans cette solution puis centrifugé. Comme précédemment, les lipides...
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