Biochimie

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  • Publié le : 6 avril 2011
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Biochimie | TD : Détermination des paramètres cinétiques Vmax (activité catalytique) et KM (constante de Michaelis) de la -galactosidase |

a) Données Boehringer :-D-galactoside galactohydrolase EC 3.2.1.23, isolée d’Escherichia coli. La -galactosidase hydrolyse les résidus -galactopryranosyl de diosides comme le lactose (Gal14Glc) et le lactulose (Gal14Fru) ; d’hétérosides comme l’ONPG(2-nitrophényl -galactoside). La -galactosidase d’Escherichia coli, dont la masse molaire est de 540 000 g.mol-1, est une protéine constituée de quatre chaînes identiques. | hydrolyse du lactose par la -galactosidase : hydrolyse de l’ONPG par la -galactosidase : |

b) Données Boehringer : KM et taux relatifs d’hydrolyse (tampon phosphate de potassium, Mg2+, 2-mercapto-éthanol, pH = 7,6, T= 30°C) :
| KM | Taux relatif d’hydrolyse |
2-nitrophényl-galactoside (ONPG) | 0,95 mmol.dm-3 | 1,00 |
4-nitrophényl-galactoside | 0,45 mmol.dm-3 | 0,14 |
phenyl -galactoside | 3,2 mmol.dm-3 | 0,05 |
lactose | 7,5 mmol.dm-3 | 0,07 |

La détermination des paramètres cinétiques Vmax et KM de la -galactosidase est entreprise. La détermination de la vitesse initiale est réaliséeselon la méthode en 2 points.

1. Étude des conditions expérimentales de la méthode en 2 points

1.1. Détermination du coefficient d'absorbance linéique molaire M de l'ONP
Le coefficient M à utiliser pour calculer la vitesse initiale en UI à partir de la vitesse initiale "brute" (en A/t) doit correspondre aux conditions de lecture de l'absorbance, après addition du réactif d'arrêt. Enparticulier, l'ONP possède une fonction phénol acido-basique et l'M dépend du pourcentage de forme déprotonée et donc du pH ; il est plus élevé en milieu alcalin. Une gamme d'étalonnage est donc réalisée en respectant les conditions acido-basiques de la lecture de la réaction enzymatique.

Réactifs :
• Solution d'ONP à 1 mmol.L-1
• Solution tampon phosphate de potassium, Mg2+,2-mercapto-éthanol, pH = 7
• Solution de Na2C03 à 1 mol.L-1

Tube : | 1 | 2 | 3 | 4 |
Tampon pH = 7 (mL) : | 2 | 2 | 2 | 2 |
Na2C03 (mL) : | 2 | 2 | 2 | 2 |
ONP (mL) : | | | | |
Eau distillée qsp (5mL) : | | | | |
[ONP] final (mmol.dm-3) : | 0,05 | 0,10 | 0,15 | 0,20 |
A420nm : | 0,233 | 0,461 | 0,683 | 0,913 |

1.1.1. Compléter le tableau de gamme.
1.1.2. Tracer la courbe A420nm =f([ONP]) et en déduire le M de l'ONP à 420 nm dans les conditions de lecture de la méthode en "2 points".

1.2. Détermination de la phase stationnaire
L'objectif est de préciser le t utilisable, ce qui suppose de connaître la durée de la période stationnaire, durée qui doit être déterminée au préalable par suivi cinétique. Réactifs : • Solution enzymatique de -galactosidase• Solution d'ONPG à 1,5mmol.L-1• Solution tampon phosphate de potassium, Mg2+, 2-mercapto-éthanol, pH = 7• Solution d'arrêt : Na2C03 à 1 mol.L-1• T° = 30°C | Détermination de la vitesse initiale par la méthode en 2 points |

Le protocole expérimental est le suivant :

Tube | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
Solution d'ONPG (mL) : | x mL |
Tampon pH = 7 (mL) : | (1-x) mL |
| Préincuber 3 minutes à 30°C |Solution de -galactosidase (mL) : | 0,5 mL |
| Mélanger et incuber immédiatement à 30°C. Arrêter la réaction par addition de 0,5 mL de Na2C03 à 1 mol.L-1 |
Arrêt de la réaction au temps t (min) : | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Lire l'absorbance à 420 nm contre le tube blanc de gamme |

Les résultats obtenus avec différentes concentrations en ONPG dans le milieu réactionnel sont présentésdans le tableau ci-dessous :

| | Temps (minute) | |
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | A/t |
[ONPG] milieu réactionnel(mmol.dm-3) | 0,1 | 0,034 | 0,068 | 0,103 | 0,136 | 0,159 | 0,182 | 0,201 | |
| 0,2 | 0,063 | 0,125 | 0,184 | 0,252 | 0,295 | 0,335 | 0,361 | |
| 0,4 | 0,106 | 0,216 | 0,324 | 0,429 | 0,535 | 0,601 | 0,643 | |
| 0,6 | 0,138 | 0,276 | 0,414 | 0,553 |...
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