Expression et purification d’une protéine fusionnée à la Glutathion-S-transférase
Objectif : Obtention de l’enzyme Isocitrate déshydrogénase (IDH) par purification et clivage de la protéine de fusion Glutathion-S-transférase-Isocitrate déshydrogénase (GST-IDH), exprimée par le plasmide pGEX-IDH dans la souche transformée E. coli JM103/pGEX-IDH, avec pGEX est en réalité pGEX-2T. I. Détermination de la taille de l’insert IDH
I.1- Construction du plasmide pGEX-IDH
L’insertion/ligation du fragment IDH dans le plasmide pGEX-2T a nécessité que l’insert IDH et le vecteur soient clivés par les mêmes enzymes de restriction (ou compatibles). Le vecteur pGEX-2T présente déjà deux sites de coupure par les endonucléases à bouts cohésifs 5’ sortants BamHI et EcoRI juste en aval du gène codant pour la GST, protéine d’~ 26 KDa. Ces sites protéolytiques BamHI et EcoRI ont dû être créés de part et d’autre de l'insert IDH, par amplification PCR à l’aide de deux amorces (~ 24 nucléotides) contenant chacune un des deux sites [ Figure 1 ]. La ligation de l’insert IDH dans le vecteur pGEX-2T a été effectuée in vitro en présence de DNA ligase avec traitement préalable du fragment et du plasmide à la phosphatase en alcaline, afin de prévenir toute fermeture du vecteur sans incorporation de l’insert BamHI GGATCC EcoRI GAATTC CCTAGG CTTAAG CATGTAA 3’ GTACATT 5’ 5’ ATGGAA
3’ TACCTT Amorce n°2 5’ GGA TCC ATGGAAAGTAAAGTAGTT 3’ → Amorce n°1 ← 3’ TAGTAGCTTTTGTACATT NCTTAAG 5’
.
Figure 1: Choix des amorces pour l'amplification par PCR de l'insert IDH, en vue du clonage dans pGEX-2T.
I.2- Mini préparation de plasmides
La mini-préparation des plasmides pGEX et pGEX-IDH est effectuée à partir d’un culot bactérien issu de la sédimentation de bactéries E. coli JM103 ayant incorporé les plasmides pGEX ou pGEX-IDH.
La lyse des membranes est effectuée par le lysozyme par