Clonage l1

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CLONAGE
VOLATIANA RAKOTOARIVELO
STEPHANIE TORRENTERAS
RESUME
Le clonage est l’exploitation provoquée d’un fragment d’ADN d’intérêt. L’étude se porte surtout sur les manipulations qui aboutissent a l’obtention des clones de ce fragment .Une digestion de l’ADN du bactériophage lambda et du plasmide (pBluescript) s’est faite par des enzymes de restriction au début de l’expérience afind’obtenir plusieurs fragments à bouts cohésifs. Une ligation est réalisée entre les fragments afin d’obtenir des plasmides recombinés. C es derniers ont été introduits dans des bactéries thermo-compétentes pour le clonage. Afin de bien vérifier la réussite des pratiques, la culture des bactéries transformées est faite dans un milieu contenant de l’ampicilline et du X-gal. Les électrophorèses permettentalors de déterminer la taille du plasmide et de l’insert lors de la digestion et des bactéries transformées. Toutefois les résultats théoriques ne sont pas souvent obtenus.

INTRODUCTION
Les travaux pratiques ont pour but l’application de toutes les théories acquises. Comment ne pas s’interroger sur l’opportunité de réaliser un clonage ? Pour reproduire a l’identique en milliers, millionsd’exemplaires un fragment d’ADN d’intérêt, on fait appel à un clonage cellulaire. C’est une pratique qui est considérée par analogie la division asexuée d’une cellule qui va donner d’innombrables cellules filles. L’obtention des clones fait face à plusieurs difficultés. Pour y aboutir, il est indispensable d’abord de métriser toutes les techniques durant les étapes inéluctables, puis d’analyser lesrésultats obtenus. Ainsi on prend conscience que tout se fait dans un ordre logique et précis. Dans le cadre de ce travaux pratique, nous avons insérer un ADN du bactériophage dans le plasmide Bluescript. Ce plasmide recombiné est ensuite introduit dans une bactérie thermo-compétentes qui vont se multiplier pour former les colonies. Encore faut-il savoir la taille des fragments. Pour celal’électrophorèse est un passage indispensable pour l’analyse de l’insert et du vecteur intégré dans la bactérie. Dans un premier temps, nous allons voir les résultats de la digestion avec la transformation des bactéries, ensuite parler des colonies obtenues, enfin analyser les bactéries transformées.

RESULTATS
RESULTAT 1 : Résultat théorique après Digestion
1 – Ecor1 : 21225 pb
Ecor1- HindIII :1904 pb
HindIII-HindIII : 2027 pb
HindIII-Ecor1 : 947 pb
EcoR1- HindIII : 1975 pb
HindIII-EcoR1 : 4272 pb
EcoR1- HindIII : 5148 pb
HindIII-HindIII : 564 pb
HindIII-HindIII : 125 pb
HindIII-EcoR1 : 1584 pb
EcoR1-HindIII : 4973 pb
hindIII-EcoR1 : 831 pb
EcoR1-HindIII : 3859 pb
HindIII-48000 : 3028 pb

Après la digestion avec les enzymes de restriction EcoR1 et HindIII, on s’attend àobtenir théoriquement 13 fragments d’ADN avec des extrémités HindIII-HindIII ou EcoR1-HindIII ou EcoR1- Ecor1.
PHOTO 1 : Cliché de l’électrophorèse après digestion

1 : Résultat obtenu par le binôme Volatiana et Stephanie.
Les deux traits correspondent à deux ADN du bactériophage lambda.
2 : Marqueur de taille indiquant la taille des fragments qui migrent vers le pôle positif
PHOTO 2 :Cliché de l’électrophorèse normalement attendu

1’: marqueur de taille
PHOTO 3 : Sélection blanc-bleue

Les taches bleues sont les colonies de bactéries transformées non recombinantes et les taches blanches sont les colonies de bactéries transformées recombinantes
Première boîte de Pétri (pBs et (n)ADN) :
Composition : -bactéries thermo-compétentes + ligation
Ligation :-plasmide digéré
-tampon de ligation
-ADN lambda digéré
-eau
-ligase
Colonies bleues environ 200 et colonies blanches environ 1568 ;
D euxième boîte de Pétri  ( pBs et (2n)ADN) :
Composition : -bactéries thermo-compétentes + ligation
Ligation : -plasmide digéré...
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