COMPTE RENDU : Sous clonage de l’ADNc Tyrosine Amino Transférase (TAT) de Rat dans le vecteur d’expression pGEM-T Introduction : A. Stratégie globale Au cours de ces travaux pratiques, notre objectif est de sous-cloner un ADNc obtenu par RT-PCR à partir d’un ARNm de la Tyrosine Amino Transférase (TAT) de Rat, enzyme impliquée dans la gluconéogenèse, dans le vecteur d’expression pGEM-T. Pour cela, l’ADNc sera introduit dans un plasmide et pourrait ainsi être transcrit in vitro en ARN, afin d’être utilisé comme …afficher plus de contenu…

· Thermocycleur· un kit PCR Clean-up system · une colonne · une centrifugeuse · solution de lavage· Eppendorf de 1,5 mL· gel d’agarose 1% dans le tampon TAE· bain marie · bac à glace · tube stérile de 13 mL· Incubateur · 4 boîtes de pétri …afficher plus de contenu…

Principe de la technique de PCR, de la purification d’ADN et de l’électrophorèse (faire un A,B,C ?) La technique de PCR (Polymérase Chain Reaction) est une technique permettant d’amplifier une séquence d’ADN d’intérêt dans le but d’obtenir un grand nombre de copies de cette dernière. 3 grandes étapes constituent cette technique : la Dénaturation, l’Hybridation et l'Élongation. On utilise 2 amorces de 16 nucléotides minimum qui reconnaissant la séquence d’intérêt à amplifier. L’une des amorce est analogue au brin 5’-3’ (Amorce F) tandis que l’autre est analogue est brin 5’-3’ mais lue à l’envers (Amorce R). L’amplification se fait en répétant 30 à 40 fois ce cycle.Figure 2 : Principe de la PCR (observation sur l’ADN)Etapes de la PCRIn VivoIn VitroDénaturationHélicase (sépare les 2 brins)94°CHybridationAmorces (fixation de l’ADN pol)Amorces à 58°CElongationEnzymes : Pol II et Pol III72°C Taq polymerase Tableau 1: Les étapes de la PCR in