Exctraction b-galactosidase

Disponible uniquement sur Etudier
  • Pages : 37 (9055 mots )
  • Téléchargement(s) : 0
  • Publié le : 15 octobre 2010
Lire le document complet
Aperçu du document
Copyright (c) Vladimir DARIC
Permission is granted to copy, distribute and/or modify this document
under the terms of the GNU Free Documentation License, Version 1.2
or any later version published by the Free Software Foundation;
with no Invariant Sections, no Front-Cover Texts, and no Back-Cover Texts.
A copy of the license is included in the section entitled "GNU
FreeDocumentation License".
Université Paris 7
DEUG SNV décembre 1997
Compte rendu de TP de BC 232 (BC-022)
1ere partie
Introduction
La constante de Michaelis et la Vmax sont deux constantes qui
caractérisent un couple enzyme/substrat. Le but de ces deux journées
de TP serra de déterminer ces constantes et de dégager les
caractéristiques et les différents aspects d'une réaction enzymatique.Extraction de la -galactosidase à partir de la
bactérie Echerichia-coli
L'étude de la β-galactosidase est faite sur un extrait cellulaire
qu'on prépare à partir d'une patte bactérienne.
Les bactéries sont cultives de façon habituelle, dans les boittes
de Pétri, sur un milieu nutritif. Par une centrifugation à faible vitesse les
bactéries sont concentrés afin d'obtenir une pattebactérienne dense.
La patte est broyé mécaniquement dans un mortier afin de
rompre les cellules. Pour faciliter le broyage on ajoute de la poudre
d'alumine et quelques gouttes du tampon T (dans la suite du texte: TpT).
Le mortier est d'abord refroidi et le TpT utilisé est glacé. Cette mesure
est prise pour inhiber les enzymes qui sont susceptibles de se dégrader
à la température de lapièce. Toute les solutions sont gardes dans la
glace pendant toute l'expérience. On choisit un tampon ayant le même
pH que le cytoplasme in vivo et donnant l'activité optimale; les enzymes
sont sensible aux changements du pH, donc il est nécessaire de
minimiser les changements de celui-ci.
Le broyât est ensuite centrifugé à 4°C pendant 10 minutes à 10
000 rpg. Les fragments les pluslourdes précipitent et se retrouvent au
fond du tube dans le culot. Le surnageant (contenant le cytoplasme) est
décanté puis le culot (les particules d'alumine, les organites, fragments
membranaires ...) est remis en suspension et centrifugé encore une fois
pour en extraire l'enzyme qui serait piégé parmi les particules lourdes.
Le deuxième surnageant est ajouté au premier et est gardédans la
glace. L'extrait cellulaire ainsi obtenu est appelé B0. Éventuellement on
complète le volume de B0 jusqu'à 20 ml. Comme, à cause du mauvais
p. 1/17
fonctionnement la balance, nous avons obtenu 25.5 ml de B0, ceci n'a
pas été nécessaire.
Dosage de l'activité de la β-galactosidase
1* - Réaction catalysé
Toutes les réaction enzymatiques se produisent selon le schéma
suivant:où: S - substrat; E - enzyme; P - produit
Le substrat "naturel" de la β-galactosidase est la lactase qui
lorsqu'elle est hydrolysé donne une molécule de glucose et une
molécule de galactose. Comme pour calculer l'activité enzymatique, il
faut mesurer la vitesse de la réaction, il est indispensable de pouvoir
suivre la réaction1. Comme ni le substrat ni le produit de cette réactionne sont facilement repérables, on va étudier une réaction similaire:
ONPG ONP + galactose
ONPG étant incolore et ONP ayant une coloration jaune, il est
possible, en mesurant l'intensité de la coloration, de suivre l'apparition
d'ONP.
2* Principe du dosage
Pour mesurer la quantité d'ONP formé on mesure la densité
optique du mélange réactionnel. Selon la loide Beer-Lambert:
D.O. = ε C l où: ε - est le coefficient d'extinction molaire
C - concentration du ONP formé
l - la longueur de la cuve (l=1cm)
Il suffit donc de suivre l'évolution de la D.O. (à 420 nm) pour
pouvoir déterminer la quantité de L'ONP formé.
Protocole:
Les mesures sont faites à la température ambiante (environ 25°
C). Une quantité de l'extrait B0 est dilué 20...
tracking img