Extraction de l'albumine du serum par chromatographie d'affinité

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  • Publié le : 11 mai 2011
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BIOCHIMIE EXPERIMENTALE 1

EXTRACTION DE L’ALBUMINE DU SERUM PAR CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITE


BUT
Le but de ce TP sera d’extraire l’albumine d’un sérum en utilisant une chromatographie d’affinité, de déterminer la concentration d’albumine dans le sérum, puis de vérifier, à l’aide d’une électrophorèse, que la chromatographie a correctement fonctionné.

PRINCIPE
Chromatographie d’affinitésur Bleu Sepharose CL-6B
La chromatographie d’affinité se fait avec une résine sur laquelle nous avons fixé un ligand ayant une affinité pour cette molécule. Ce ligand se lie spécifiquement à la molécule. L’adsorption consiste à mettre en présence un mélange contenant la molécule d’intérêt et la résine contenant le ligand, dans des conditions favorables à la liaison ligand-molécule spécifique.Les molécules n’ayant pas d’affinité pour le ligand ne se fixeront pas sur la résine et pourront être éluées, tandis que celles ayant une affinité resteront attachées. Ensuite, quand toutes les molécules sans affinité sont complètement éliminées, nous procédons à la désorption des molécules restées attachées au ligand. Ceci se fait en exposant le complexe résine-molécules spécifiques à desconditions physico-chimiques où l’interaction ligand-molécules spécifiques est moins stable. Ces dernières se détacheront alors de la résine, élueront dans le solvant de désorption et pourront être récupérées.
L’élution s’effectue dans un collecteur de fractions programmé à 1,5mL (soit 50 gouttes) car le volume utilisé pour le dosage spectrophotométrique de la gamme étalon est de 1,5mL. Chaque tube dosédoit avoir le même volume (1,5mL), auxquels nous ajoutons 2mL de Biuret.

Réaction du Biuret
La réaction du Biuret est la formation d’un complexe pourpre entre le Biuret (NH2-CO-NH-CO-NH2) et de deux liens peptidiques consécutifs en présence de cuivre en milieu alcalin. Le complexe de coordination résultant absorbe fortement dans le bleu (540nm). Ce qui permet de doser les protéines parspectrophotométrie.

Spectrophotométrie
A l’aide d’un spectrophotomètre, nous pouvons mesurer l’absorbance A (ou DO) d’une solution. C’est-à-dire sa capacité à absorber la lumière d’une certaine longueur d’onde, et cette absorbance est directement liée à la concentration selon la loi de Beer-Lambert :

A = Ɛ x l x C avec Ɛ = coefficient d’absorption molaire (L.mol-1.cm-1)
l =épaisseur de la cuve (cm)
C = concentration de l’espèce chimique dosée (mol.L-1)
Gamme étalon
Nous établissons une gamme étalon de 7 tubes contenant l’albumine à doser dans des concentrations connues. La droite [A = f (concentration en albumine)] sera utilisée pour trouver la concentration initiale d’albumine dans le sérum, à partir de son absorbance.

Electrophorèse
C’est le déplacement departicules chargées sur une bande d’acétate de cellulose sous l’influence d’un champ électrique, dans un tampon véronal de pH=8,8. Toutes les protéines se chargent négativement et migrent vers l’anode à des vitesses différentes. Ce qui permet de les séparer et, après les avoir colorées (rouge ponceau), nous pouvons les caractériser à l’aide de témoins. Nous effectuerons notre électrophorèse sous155V.

RESULTATS – INTERPRETATIONS
Chromatographie d’affinité sur Bleu Sepharose CL-6B
Grâce au collecteur de fractions, nous avons recueilli 21 tubes. Nous avons ajouté 2mL de Biuret aux tubes numérotés impairs, puis nous avons lu leurs absorbances au spectrophotomètre. Nous avons également préparé deux tubes qui sont les blancs de la chromatographie d’affinité tels que :

Tubes 8 9Tampon A (mL) 1,5
Tampon B (mL) 1,5
Biuret (mL) 2 2
DO mesurée 0.133 0.132

Nous avons déposé 0,7mL de sérum dans la colonne de chromatographie. Nous avons fait passer dans un premier temps le tampon A, puis dans un second temps le tampon B. Le tampon A sert à éluer les toutes les protéines du sérum sauf l’albumine. La force ionique du tampon B permet de décrocher l’albumine du sérum. Nous...
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