B-L’hybridation permet le repérage d’une séquence d’ADN

Digestion par enzyme de restriction

ADN génomique extrait

Fragments d’ADN Électrophorèse Séparation par taille

Hybridation avec sonde sb marquée Choix température
*

Transfert sur membrane Par capillarité Dénaturation par NaOH Fixation

Lavage autoradiographie

b-les autres types d’hybridation

Hybridation de colonies bactériennes Puces à ADN

L’ARN peut aussi être hybridé : northern blot

L’hybridation sur puce pour réaliser la carte d’identité d’une tumeur

1

Créer des molécules d’ADN recombinant – vecteur de clonage Le phage M13 Filamenteux Pas de lyse bactérienne Infection par pilus sexuel par injection d’ADN sb Forme réplicative db Sécrétion de phages à ADNsb encapsidé

Vecteurs : intégration ADN dans une zone intergénique Avantages : -ADN sb ou db -taille 6 x plus importante que celle du virus peut être encapsidée

Cycle du phage lambda

b-clonage d’ADN étranger dans un vecteur

-Digestion de l’ADN plasmidique -Déphosphorylation des extrémités 5’ du plasmide -Purification du fragment à intégrer -Ligation par une ligase + ATP -vérification par électrophorèse

Clonage de bouts francs : + difficile Rendre les extrémités de l’insert et du plamide cohésives : + efficace

2

Il faut amplifier le vecteur recombinant

c- du plasmide pBR 322 au phagemides, cosmides, BAC et YAC

pBR 322 4000pb ; 1 origine de réplication ; 2 gènes de résistance à 2 antibiotiques ; des sites de restriction (carte de restriction)

Sélection des recombinants

c- du plasmide pBR 322 au phagemides, cosmides, BAC et YAC

ο

Autre système de sélection : lac Z Dérivé de l’opéron lactose α complémentation du mutant de E. coli délété dans le gène de la β galactosidase En présence d’inducteur, l’IPTG (isopropyl-β-Dthiogalactoside), la β-galactosidase transforme le Xgal (5-bromo-4 chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) en 5-bromo-

4chloroindoxyle qui à l’air donnera un dérivé de l’indigo