Hplc biochimie

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  • Publié le : 25 mars 2011
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Le Goaziou Thomas
Desbois Léo
H.P.L.C phase inverse : influence de la polarité de la phase mobile
Objectif :
Apprendre à manipuler l’appareil et doser la caféine contenue dans le coca.Principe :
La H.P.L.C fonctionne comme une chromatographie liquide classique de migration différentielle par différence de polarité, mais elle se fait à haute pression. Cela permet d’accélérer la vitesse desparticules et donc d’obtenir un résultat de façon plus rapide. Elle est dite « inverse » car la phase stationnaire est apolaire (groupe octadécylsilyl), et la phase mobile est plus ou moins polaire(mélange eau+méthanol). Les substances les plus polaires seront donc éluées en premières.
Schéma de principe de la H.P.L.C

Manipulation:
Après avoir fait circulé pendant 10minutes le mélangeméthanol40%-eau. On a injecté 20µL de caféine et lancé l’enregistrement. On obtient le graphe en annexe 1 avec un pic à 3,22minutes.
Puis on injecte 20 µL de théophylline et l’on obtient sur le graphe(annexe 2) un pic à 2,23minutes.
Ensuite on injecte 20 µL de théobromine et l’on obtient (annexe 3) un pic à 1,74minutes.
Enfin, on injecte 20µL d’un mélange des trois substances et l’on se rend compte(annexe 4) que les temps de rétention sont les mêmes mais que les aires des trois pics se chevauchent. Ce qui empêche toute analyse quantitative mais permet néanmoins une analyse qualitative. C’estpourquoi on peut tout de même se servir de ce graphe pour vérifier lequel de ces alcaloïdes est présent dans le coca.
On injecte donc 20 µL de coca et l’on obtient deux pics majoritaires (annexe5)dont l’un avec un temps de rétention de 3,307minutes. On est donc à 0,1minute près du pic enregistrer précédemment de caféine. On peut donc affirmer que le coca contient de la caféine.
Influence de lapolarité de l’éluant
But :
Espacer les aires des pics afin de réaliser un étalonnage pour ensuite déterminer la concentration en caféine dans le coca.
Principe :
Etant donné que l’éluant ne...
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