Hplc

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Section 2 item 5

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE - HPLC
Introduction 1 Appareillage
1.1 Réservoir de PM 1.2 Pompe 1.3 Dispositif d’injection 1.4 Les colonnes 1.5 La phase stationnaire 1.6 Les détecteurs 1/Spectrophotométrique +++ 2/Fluorimétrique 3/Réfractometre 4/Condutimètre 5/Electrochimique 6/SM

2 Différents types de chromatographie liquide
2.1 Chromatographie d’adsorption (S/L) 2.2Chromatographie de partage (L/L) +++ En phase normale En phase inversée 2.3 Chromatographie par échanges d’ion 2.4 Chromatographie par appariements d’ions ou paire d’ions 2.5 Chromatographie d’exclusion-diffusion 2.6 Chromatographie d’affinité

3 Choix d’une méthode chromatographique

Pharmaetudes

Section 2 item 5

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Section 2 item 5

1 Appareillage
Ø 2 grands typed’appareillage : o La chromatographie « Classique » : § Granulométrie > 10µm § Appareillage simple :Tube en verre avec plaque en verre fritté à la base ou tampon de coton § substances descendent le long de la colonne selon affinité § recueil de l’éluat par petites fractions § Mais : ü peu sensible ü long ü peu d’analyse de trace ou dosage o La chromatographie haute performance (HPLC) §Granulométrie entre 2-10 µm § Meilleure efficacité et résolution § Très utilisé +++

Ø

Structure générale d’un HPLC :

A : réservoir de PM B : Vanne électro magnétique de mélange des PM C : Pompe D : Egaliseur de pression E : Chambre de mélange F : Injecteur G : colonne H : Unité HPLC I : Détecteur J : Interface PC

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1.1 Réservoir de PM
Ø Ø Ø Flaconétanche (1 à 2L) Parfois fois munis d’un syst de dégazage (évite bulles d’air) Différents modes : o mode isocratique = PM de compo cte au cours l’extraction (analyse possible avec 1 seul réservoir) o mode programmation de solvant (+ cplxe) =gradient de polarité (nécessite pls réservoirs)

NB : les appareils pouvant travailler en prog peuvent travailler en isocratique mais ce n’est pas réciproque1.2 Pompe
Ø Ø Fonctionne / piston alternatif (svt à pls pistons) à Assure un débit cst Appareil à gradient de polarité : o syst de vannes EM proportionnelles qui permet les mélanges des solvants en amont d’une pompe unique (ces vannes s’ouvrent en tps proportionnel) Qualités : -pas de pulsation -résiste à la corrosion -débit constant

Ø

Schéma Huguette gradient de PM

Pharmaetudes Section 2 item 5 1.3 Dispositif d’injection
Ø Ø Ø Injection manuelle ou automatique avec un passeur d’ech P° élevée en tête de colonne dc impossible d’injecter à la seringue comme en CPG Syst d’injection particulier à Injecteur à boucle : o vanne à boucle d’échantillonnage ,commandé manuellement o Vol : 1 à 100µl o Assure des injections très répétables o Ces boucles ont des volumes variableso La boucle peut être mise en communication par des vannes avec le réservoir de ϕm et la colonne

Ø Ø Ø Ø

Remplissage de la boucle à P° atm Le trop plein est rejeté vers l’ext Pdt cette étape , la ϕm circule en permanence sur la colonne. Puis injection du contenu de la boucle en tournant la vanne d’injection ,la ϕm est mise en communication avec la boucle et la colonne

Pharmaetudes Section 2 item 5 1.4 Les colonnes
 
Ø Ø Ø Ø Tubes droits en acier inoxydable 5 à 30 cm de long 3 à 4.6 mm de ∅ interne (auj ,∃en a de 2 mm) qlq fois , on place en amont une colonne de garde =petite colonne courte (1 à 2 cm ) remplit avec la même ϕs que la colonne analytique

1.5 La phase stationnaire (voir type de chromato correspondante)
Ø Ø Située dans la colonne 2 types de PS : oPS imprégnées : § Phase solide de silice retenant à sa surface les composés § Surtt utilisé en chromato d’adsorption (S/L) o PS greffées +++ § Formées par formation de liaisons covalentes entre les gpt silanols de la silice et des molécules organiques de nature variées § Le plus courant = diméthylchlorosilane § Les carac de la PS greffée sont déterminées par la nature du gt gréffés §...
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