1. But du TP

L’objectif de ce TP est de purifier une solution contenant de nombreuses protéines afin de récolter l’enzyme lactate déshydrogénase et déterminer son activité spécifique.

2. Principe

La lactate déshydrogénase (LDH) est l’enzyme catalysant la réaction :

L-lactate + NAD+ Pyruvate + NADH + H+

Elle existe sous 5 formes rmes d’isoenzymes qui différent par leur pH isoélectrique.

➢ Chromatographie d’affinité

Afin de la purifier un extrait de tissu fœtal bovin contenant cette enzyme, on réalise une chromatographie d’affinité. Le bleu de Cibacron qui présente une analogie avec le cofacteur NADH, le ligand naturel de la lactate déshydrogénase, est fixé par liaison covalente sur des billes de gel (phase stationnaire). Puis on effectue un lavage avec un tampon afin d’obtenir des conditions chimiques favorables à la fixation de l’enzyme sur le gel.

➢ Electrophorèse

- En milieu dénaturant (SDS-Page)
L’électrophorèse en milieu dénaturant permet de séparer les différentes protéines contenue dans la fraction de départ et dans la fraction purifiée afin de comparer les quantités de protéines différentes avant et après purification. La révélation au bleu de Coomassie colore toutes les protéines spécifiquement.

- Non dénaturante
Une électrophorèse non dénaturante discrimine les protéines en fonction de leur charge. Les protéines chargées négativement migrent vers l’anode (+) alors que les protéines chargées positivement migrent vers la cathode (-). Elles est réalisée à un pH basique de 8,8. Ce type d’électrophorèse permet de séparer les isoenzymes de la lactate déshydrogénase en fonction de leur pH isoélectrique
La révélation de l’électrophorèse non dénaturante se fait par mise en évidence spécifique de l’activité de la lactate déshydrogénase par formation d’un précipité bleu : le milieu réactionnel utilisé contenant du NAD+ et du L-lactate, l’enzyme catalyse la réaction

L-lactate + NAD+ ----> Pyruvate + NADH + H+

L’ion H+ libéré