La photolyse de l eau au niveau du photysteme ii ( reaction de hill)

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  • Publié le : 10 décembre 2011
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Etude de la réaction de Hill : suivi spectrophotométrique de la réduction de l’accepteur final (DPIP)

Résumé :
La réaction de Hill permet de mettre en évidence le dégagement de dioxygène par la plante engendrée lors de la photolyse de l’eau présente dans la chaîne de transport photosynthétique des électrons. Pour réaliser l’expérience, on remplace l’accepteur final naturel, NAD+, par le DPIP(2,6 dichlorophénolindophénol). Cette réaction se fait sur des chloroplastes dont la concentration est déterminée indirectement par la méthode de Mac Kinney d’après leur densité optique. L’accepteur final et les chlorophylles sont ensuite mis en commun pour réagir dans différentes conditions. Les résultats nous indique la lumière est nécessaire pour une action complète des chloroplastes car, àl’obscurité, le transfert d’électrons est interrompu par l’inactivation des photosystèmes. De plus, une température importante (100°C) dénature les chlorophylles et bloque donc leur action. En condition normale, le DPIP est progressivement réduit et donc le dioxygène de plus en plus dégagé dans le milieu extérieur. (150 mots)

Introduction :
Les végétaux comme d’autres êtres vivants autotrophesutilisent l’énergie lumineuse pour la synthèse de molécules organiques, ceci est le phénomène de photosynthèse. La lumière absorbée provoque un transfert d’électrons dans la membrane des thylakoïdes des chloroplastes durant les réactions photochimiques : c’est la réaction de Hill. Cette réaction d’oxydoréduction se résume, in vivo, par l’équation suivante : 2H2O + chloroplastes + lumière----------> 2H2 + O2 + e-. Le NADP est le potentiel réducteur. Ceci se résume dans le schéma en Z représentant le transfert d’énergie par les électrons lors du transport acyclique :

Figure 1 : Schéma en Z
L’accepteur final utilisé in vitro sera le 2,6 dichlorophénolindophénol (DPIP). L’expérience consiste à mettre en évidence la réaction de Hill par une méthode spectrophotométrique permettant de suivreles variations de densité optique lors de la réduction du DPIP. On pourra ensuite en déduire par la suite l’oxygène dégagé lors de la réaction de Hill.

Matériel et méthodes :

➢ Préparation de la suspension de chloroplastes :
40 g d’épinards (placés à l’obscurité) sont broyés dans un pilon dans 100 ml de milieu d’extraction puis filtrés. Ils sont ensuite centrifugés 10 mn à 4000tours par minute. Nous obtenons ainsi des culots de chloroplastes dissociés du surnageant qui sont remis en suspension dans 10 ml du milieu d’extraction. Les chlorophylles contenues dans les chloroplastes sont séparées de leur thylakoïdes grâce à un mélange d’acétone et d’eau et une centrifugation à 10000 tours par minute. La mesure de densité optique des chlorophylles à 645 et 663 nm permet decalculer leur concentration dans le milieu par la formule de Mac Kinney :
Chla = (0.0127 * DO663 – 0.00269 * DO645) * 50 = 0.1234 g/L

Chlb = (0.0229 * DO645 – 0.00468 * DO663) * 50 = 0.0509 g/L

Chl = Chla + Chlb = (0.0202 * DO645 + 0.00802 * DO663) * 50 = 0.1743 g/L

Où 50 est le facteur de dilution (unité en g/L).

Pour permettre les différentes préparations et leursmesures de densités optiques, la concentration de la suspension de chloroplastes doit être d’environ 60 μg/ml Nous avons donc dilué 3 fois la solution mère pour obtenir une concentration de 58 μg/ml

➢ Préparation des produits de réaction :
2,6 dichlorophénolindophénol ou DPIP (représenté par A dans la réaction suivante) est l’accepteur d’électrons exogène utilisés pour la réactionde Hill car le plus adapté à la spectrophotométrie (cf. PRAT R.) :
H2O + A + chloroplastes + lumière ---------- > AH2 + 1/2 O2 + 2 e-
Le DPIP à l’état oxydé est de couleur bleue alors qu’il est incolore à l’état réduit. Il est associé aux chloroplastes dans différents tubes selon les conditions suivantes :

Tableau 1 : Caractéristiques des préparations pour le spectrophotomètre...
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