Le clonage directionnel

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  • Publié le : 18 avril 2011
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Badji Fatou Mbaye
Rugen Nicolai
L3 BBCP
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Le clonage directionnel
I-Introduction
Le clonage est une technique de biologie moléculaire qui Le clonage consiste à insérer un segment d'ADN étranger dans une petite molécule capable de se répliquer de façon autonome. Ce type de molécule d'ADN est appelé un vecteur de clonage.

Un vecteur declonage courant est le plasmide bactérien.
Il existe 2 types de clonage :le clonage directionnel qui consiste à insérer le fragment dans un sens et le clonage non orienté qui consiste a inséré dans le fragment dans les 2 sesns.
II -En pratique :
2 . Amplification in vitro du gène à cloné par PCR:
Dans un tube Eppendorf :sont ajoutés:de l'eau ultra pure stérile,une matrice d'ADN du gène,une amorcesens et une amorce anti sens toutes, le MgCl2, le tampon d'amplification,des dNTP .le tube est mélangé et maintenu au froid avant l'introduction de la Go Taq DNA Polymerase .Le tube est inséré dans l'appareil à PCR préalablemnt programmer pour une durée de 3 heures pour 30cycles de la façon suivante : -dénaturation 92°C 30S, -hybridation 56°C 1min , -élongation 72°C 1min.
3.Digestionenzymatique de L'ADN du plasmide et au fragment d'ADN étranger coupé par la même enzyme de restriction ou une enzyme qui donne des extrémités compatibles.
2. Purification et extraction de l’ADN
Deux techniques sont utilisés pour extraire te purifier le produit de PCR et le plasmide.
L'ADN sera déposé sur le gel d'agarose à 1% et extrait par freeze-queeze (congélation dans l'azot e liquide puiscentrifugation durant 15min à 10000g,L'ADN et ensuite purifié et extrait par une solution phénol/chloroforme/alcool isoamylique aprés centrifugation pendant 10min puis 5 min à 10000g et à 4°C.Deux volume d'éthanol seront ajoutés par volume d'échantillon pour précipitrer l'ADN en présence d'acétate de sodium 3M pH 5.

3. Ligature:
Le produit de PCR est ensuite ligature dans le plasmide en présencedu tampon de ligature (2X), l'insert et le vecteur dans un rapport de 2/1, la T4 DNA ligase (3U/µL) et de l'eau (qsq 10µL).

5.Transformation bactérienne
On ajoute le produit de la ligature à des bactéries traitées au CaCl2 et on soumet l'ensemble à un bref choc thermique (placé sur la glace ,transfère dans un bain-marie (42°C, 50'') avant d'être remis sur glace (2').
Pour identifier lesbactéries transformées, on utilise des marqueurs de sélection portés par le plasmide. Les marqueurs de sélection les plus utilisés sont les gènes de résistance à des antibiotiques, comme l'ampicilline, la tétracycline….
Par la suite, les bactéries transformées sont cultivées en présence de l'antibiotique de manière à éviter que la bactérie ne perde le plasmide qu'on y a introduit.
III-Clonagedirectionel :
Le clonage directionnel suit les même étapes classique du clonage .Mais Le clonage directionnel est un clonage dans lequel le fragment cloné ne peut se cloner que dans un sens et impose certaines conditions :
* Le choix du vecteur
On utilisé un plasmide portant des polylinkers (en français, « région à sites multiples de clonage ») qui est une courte séquence d'ADN contenant 8 à 16sites de coupure uniques pour des enzymes de restriction) car il est souvent souvent aisé de trouver des sites de restriction qui sont compatibles avec les extrémités du fragment à cloner.;

Figure1: Localisation du polylinker sur le plasmide pGEM-7Zf


* Les enzymes de restrictions :
les enzymes de restrictions qui seront utilisées pour digérer le vecteurs et le fragment d’ADN à insérédoivent avoir un site dans le polylinker. Se sont deux enzymes de restrictions différentes qui sont utilisées se qui permet d’orienter le fragment inséré dans le plasmide.

Exemple clonage directionnel d’un gène dans le plasmide pUC19

Figure 2 : Structure du plasmide pU19 
Il y’a une site multiple de clonage au niveau
d'une portion du gène de la β-galactosidase
E. coli (LacZ')....
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