I- But :
Le but de ce TP est d’obtenir l’isocitrate déshydrogénase (IDH) par voie recombinante. On utilise comme système d’expression E.coli (souche JM109) transformé par le plasmide pGEX-2T dans lequel on a inséré le gène de l’IDH. L’IDH recombinante exprimée est en fusion avec la glutathion-S-transférase (GST) à des fins de purification par chromatographie d’affinité sur une colonne glutathione sepharose 4B. L’IDH peut être étudiée et dosée après clivage de la protéine de fusion par la thrombine.

II- Principes

III- Interprétations des résultats

Culture

On réalise 30 mL de préculture bactérienne à partir d’une colonie isolée transformée par le vecteur pGEX-2T-IDH dans un bouillon de culture BL contenant de l’ampicilline à 50µG.mL-1. La préculture incube pendant une nuit à 37°C sous agitation. Au matin la Densité optique de la préculture est mesurée après dilution au dixième. Il est ajouté dans un litre de bouillon BL un volume de préculture tel que la densité optique de la culture ainsi obtenue soit proche de 0,1.
On surveille la croissance bactérienne de la culture pendant la matinée. Lorsque la densité optique de la culture atteint 0.6 on prélève un aliquot de la culture et de l’IPTG est ajouté à la culture de façon à induire l’expression de la protéine.

Analyse de l’electrophorèse d’ADN sur gel d’agarose

Le gène de l’IDH a une taille d’environ 1.2kb et pGEX a une taille d’environ 4.9kb. Lors des digestions on aura donc des fragments de taille compris entre 1.2 kb fragments pour la séquence de l’IDH libéré par la digestion et 6.1kb pour le plasmide entier pGEX-2T-IDH. Le choix de la concentration du gel se portera donc sur une concentration de 0.8%d’agarose qui permet de résoudre des fragments entre 800 et