Immobilisation de la pectinase sur gel sepharose-4B : I. Principe
Le but de cette manipulation a été de fixer, sur le gel de la colonne, de la pectinase. La pectinase est une enzyme capable de décomposer la pectine qui est un polysaccharide présent au niveau de la paroi cellulaire des plantes. Sa fixation est possible grâce à un intermédiaire : la concanavaline A.
Cette technique implique que la pectinase doit être fixée de façon covalente à un support solide. Ce support solide est la Sépharose (le gel). Un agent de réticulation est nécessaire afin de créer un lien entre la colonne et l’enzyme, cet agent étant la concanavaline A.
Différentes étapes sont nécessaires afin de réaliser cette fixation. Tout d’abord, il y a une étape de fixation de la concanavaline A sur le Sépharose. L’agent de fixation doit ensuite être activé grâce à un mélange d’ions métalliques. Puis une étape de fixation entre la concanavaline et la pectinase est possible grâce à des liaisons hydrophobes. Ces étapes constituent alors ce que l’on appelle une « couche ».
Figure : schématisation des différentes couches de fixation de la pectinase.

Concanavaline A
Concanavaline A

Pectinase
Pectinase

2ème groupe
2ème groupe
Gel sépharose
Gel sépharose
1ergroupe
1ergroupe

Lors de notre TP nous avons réalisé et étudié, en mesurant certains paramètres, la fixation de la deuxième couche (la première couche ayant été préalablement fixée par le groupe 1). II. Protocole
Après l’ajout de la deuxième couche de concanavaline A sur la colonne Sépharose, la colonne est activée par passage d’un tampon d’activation (acétate de sodium contenant des ions divalents). La pectinase peut ensuite être ajoutée. Une succession de différents rinçages est effectuée afin d’éliminer les enzymes en excès et non fixées ainsi que pour nettoyer la colonne.
Des dosages de l’activité enzymatique et des protéines totales sont réalisés sur les solutions de rinçage.

III. Résultats 1) Dosage