Pectinase

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  • Publié le : 27 décembre 2011
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Immobilisation de la pectinase sur gel sepharose-4B :
I. Principe
Le but de cette manipulation a été de fixer, sur le gel de la colonne, de la pectinase. La pectinase est une enzyme capable de décomposer la pectine qui est un polysaccharide présent au niveau de la paroi cellulaire des plantes. Sa fixation est possible grâce à un intermédiaire : la concanavaline A.
Cette technique impliqueque la pectinase doit être fixée de façon covalente à un support solide. Ce support solide est la Sépharose (le gel). Un agent de réticulation est nécessaire afin de créer un lien entre la colonne et l’enzyme, cet agent étant la concanavaline A.
Différentes étapes sont nécessaires afin de réaliser cette fixation. Tout d’abord, il y a une étape de fixation de la concanavaline A sur le Sépharose.L’agent de fixation doit ensuite être activé grâce à un mélange d’ions métalliques. Puis une étape de fixation entre la concanavaline et la pectinase est possible grâce à des liaisons hydrophobes. Ces étapes constituent alors ce que l’on appelle une « couche ».
Figure : schématisation des différentes couches de fixation de la pectinase.

Concanavaline A
Concanavaline A

Pectinase
Pectinase2ème groupe
2ème groupe
Gel sépharose
Gel sépharose
1ergroupe
1ergroupe

Lors de notre TP nous avons réalisé et étudié, en mesurant certains paramètres, la fixation de la deuxième couche (la première couche ayant été préalablement fixée par le groupe 1).
II. Protocole
Après l’ajout de la deuxième couche de concanavaline A sur la colonne Sépharose, la colonne est activée par passaged’un tampon d’activation (acétate de sodium contenant des ions divalents). La pectinase peut ensuite être ajoutée. Une succession de différents rinçages est effectuée afin d’éliminer les enzymes en excès et non fixées ainsi que pour nettoyer la colonne.
Des dosages de l’activité enzymatique et des protéines totales sont réalisés sur les solutions de rinçage.

III. Résultats
1) Dosagedes protéines
Le dosage des protéines par la méthode micro-Bradford repose sur le principe d’une liaison du bleu de Coomassie aux protéines, entraînant l’apparition d’une coloration bleue quantifiable au spectrophotomètre. Cette méthode permet ainsi de quantifier les protéines (de quantité inférieure à 30 µg) en solution à l’aide d’une méthode d'analyse spectrophotomètrique. L’intensité de lacoloration témoignera donc de la quantité de protéines présente dans l’échantillon.
Une courbe étalon est tout d’abord réaliser, dans un premier temps, afin de remonter à la concentration en protéine grâce à l’intensité de la lumière.

La courbe établie a un coefficient de corrélation convenable, on peut donc prendre en référence cet étalonnage. L’équation de la droite est la suivante : Y=0.0475*X* Mesures sur échantillons
Grâce à l’équation de la courbe étalon, nous pouvons connaitre la quantité de protéine présente dans l’échantillon de la pectinase grâce à une équation :
Quantité de protéines (µg)=Do*10000.0475*Vol prise (µL)* Vol échantillon (mL)
Tableau : Résultat des expériences mesurant la quantité de protéine dans les échantillons prélevés sur la colonne
| | | | | || Volume (mL) | Quantité (µL) | DO | C | C moyennes(µg/µL) | Quantité en protéine (µg/colonne) |
déposé | 5 | 400 | 0,152 | 0,08 | 0,0775 | 387 |
| | 600 | 0,216 | 0,075 | | |
L1 | 4,4 | 100 | 0,253 | 0,053 | 0,05 | 220 |
| | 200 | 0,451 | 0,047 | | |
L2 | 9,5 | 200 | 0,181 | 0,019 | 0,01865 | 176,7 |
| | 300 | 0,267 | 0,0183 | | |
L3 | 9,4 | 300 | 0,212 | 0,0146 |0,01445 | 136,77 |
| | 600 | 0,41 | 0,0143 | | |
L4 | 9,7 | 600 | 0,196 | 0,006877 | 0,006886 | 65,96 |
| | 800 | 0,262 | 0,006895 | | |
Déposé : correspond au tampon élué après la mise en place de la première couche.
L1 : premier lavage après la deuxième couche fixé.
L2 : deuxième lavage après la deuxième couche fixé.
L3 : troisième lavage après la deuxième couche fixé.
L4 :...
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