Pour romain

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  • Publié le : 26 avril 2011
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Séquençage

PROTOCOLE INITIAL
4 mélanges sont préparés: - le fragment qui doit être séquencé - un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à l'extrémité 3' du fragment à séquencer= amorce - les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) - l'ADN polymérase

(vecteur)

PRINCIPE : Technique de Sanger
Pour le séquençage des nucléotides légèrement différents sont utilisés: lesdidésoxyribonucléotides (ddNTP) au lieu des désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP).

PROTOCOLE INITIAL
4 mélanges sont préparés: - le fragment qui doit être séquencé - un petit morceau d'ADN dont laséquence est complémentaire à l'extrémité 3' du fragment à séquencer = amorce - les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) - l'ADN polymérase

(vecteur)

Un des nucléotides est marqué au 35S L'utilisation d'un ddNTP permet d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN de différentes tailles, correspondant aux emplacements d'un nucléotide donné exemple: synthèse du brin complémentaire, et arrêtaléatoire par un ddGTP quand il y a une Cytosine sur la séquence

• Liaison de l’amorce avec l’ADN à séquencer. • La fixation des ddNTP aux brins d’ADN va créer des brins de différentes tailles. • Lesbrins vont migrer sur un gel d’électrophorèse selon leur taille : le plus petit migre le plus vite.

Lecture de la séquence - Séquençage « à la main » - Électrophorèse sur gel d'acrylamide. -Détection des fragments d'ADN, en exposant un film photographique au gel. Un des dNTP est marqué au 35S, rendant le fragment radioactif Suivant la taille des gels la séquence lue est limitée de 200 à 750nucléotides environ

Animation de la technique de séquençage

EVOLUTION DE LA TECHNIQUE DE SANGER - Didésoxynucléotides marqués avec des fluorophores

- Le séquençage des produits de PCRAUTOMATISATION - Les séquenceurs en gel plat - Les séquenceurs capillaires

EVOLUTION DE LA TECHNIQUE DE SANGER - Didésoxynucléotides marqués avec des fluorophores

- Le séquençage des produits...
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