Purification de la thrombine

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  • Publié le : 28 mars 2011
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TP : Purification de la Thrombine

Résumé :
La thrombine est une enzyme protéolytique impliquée dans la coagulation du sang et l’agrégation des plaquettes. Elle est synthétisée dans le foie et sécrétée sous forme de prothrombine qui va être clivée en thrombine.
Le but de ce TP est d’isoler cette prothrombine et pour cela 3 étapes sont nécessaires : précipitation au BaCl₂, dialyse etchromatographie échangeuse d’ions. La dialyse pouvant durer plusieurs jours, seules les 2 autres étapes vont être réalisées dans ce TP. Deux notions importantes vont être abordées, tout d’abord une notion de rendement puis une notion de taux de pureté à partir des étapes de précipitation au BaCl2 et de purification par chromatographie échangeuse d’ions.
En effet durant la première étape deprécipitation au BaCl2 une mesure par spectrophotométrie à 405nm est prise de chaque solution afin de mesurer l’activité enzymatique dans les solutions diluées au préalable de plasma, S1, C1, S2 et C2. Les résultats obtenus pour ces mesures vont permettre de nous renseigner sur la quantité de prothrombine précipitée, le but étant d’en avoir un maximum. Si la manipulation est bien effectuée cette activitéenzymatique doit donc être plus importante dans la dilution C2 que dans C1, la seconde précipitation (et centrifugation) ayant pour but de précipiter un maximum de prothrombine.
Pendant l’étape de chromatographie échangeuse d’ions les fractions sont également étudiée par spectrophotométrie cette fois à 280nm afin de nous renseigner sur la quantité de protéine et d’identifier la fraction contenantnotre protéine d’intérêt: la prothrombine. En effet celle-ci fait un pic d’absorbance étant donné qu’elle est présente en majorité. Ultérieurement on mesure l’activité enzymatique de cette fraction contenant la prothrombine.

I- Introduction

La thrombine ou facteur IIa est une enzyme protéolytique qui appartient à la famille des sérines protéases. Elle est bicaténaire c’est-à-dire qu’elle estcomposée d’une chaîne lourde de 259 aa et d’une chaîne légère de 36 aa.

Structure tridimensionnelle de la Thrombine
La thrombine exerce des fonctions essentielles dans la biologie des vertébrés. En effet c’est l’enzyme centrale impliquée dans la coagulation du sang et l’agrégation des plaquettes. Pour cela, elle va transformer le fibrinogène en fibrine et activer les plaquettes parl’intermédiaire de la protéolyse limitée d’un récepteur spécifique.
Elle est synthétisée dans le foie et sécrétée dans la circulation générale sous forme de prothrombine. La prothrombine aussi appelée facteur II est une chaîne polypeptidique qui va être clivée en thrombine. Cette transformation de la prothrombine en thrombine peut aussi se faire grâce à un poison: l'écarine, qui une fois injectédans le sang va clivée le facteur II en facteur IIa et provoquer une importante thrombose.
Ces informations sont tirées en grande partie de sites internet mais en consultant également le cours.
3 étapes sont nécessaires à la purification de la prothrombine: précipitation au BaCl₂, dialyse et chromatographie échangeuse d’ions. Au cours de ce TP seulement 2 de ces 3 étapes vont être réalisées, eneffet la dialyse est une longue étape qui doit durer plusieurs jours.
On pourra ainsi constater que, dans un premier temps la prothrombine va précipité dans le culot grâce au BaCl₂, puis, après le passage dans la colonne et suite à divers lavages, on pourra récupérer la fraction contenant notre protéine éluée. Cette fraction sera déterminée grâce au pic présent lors de la mesure d’absorbance. Ainsion aura récupéré en fin de TP, après la purification de la prothrombine, notre protéine d’intérêt : la thrombine.

II- Méthodes

Précipitation au BaCl2
La précipitation au BaCl2 a pour but d’isoler la prothrombine en se servant de sa capacité à fixer les ions Ba2+ qui ont la propriété de remplacer les ions Ca2+. Cette technique de précipitation consiste à mettre en excès le Barium afin...
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