TP : Purification de la Thrombine

Résumé :
La thrombine est une enzyme protéolytique impliquée dans la coagulation du sang et l’agrégation des plaquettes. Elle est synthétisée dans le foie et sécrétée sous forme de prothrombine qui va être clivée en thrombine.
Le but de ce TP est d’isoler cette prothrombine et pour cela 3 étapes sont nécessaires : précipitation au BaCl₂, dialyse et chromatographie échangeuse d’ions. La dialyse pouvant durer plusieurs jours, seules les 2 autres étapes vont être réalisées dans ce TP. Deux notions importantes vont être abordées, tout d’abord une notion de rendement puis une notion de taux de pureté à partir des étapes de précipitation au BaCl2 et de purification par chromatographie échangeuse d’ions.
En effet durant la première étape de précipitation au BaCl2 une mesure par spectrophotométrie à 405nm est prise de chaque solution afin de mesurer l’activité enzymatique dans les solutions diluées au préalable de plasma, S1, C1, S2 et C2. Les résultats obtenus pour ces mesures vont permettre de nous renseigner sur la quantité de prothrombine précipitée, le but étant d’en avoir un maximum. Si la manipulation est bien effectuée cette activité enzymatique doit donc être plus importante dans la dilution C2 que dans C1, la seconde précipitation (et centrifugation) ayant pour but de précipiter un maximum de prothrombine.
Pendant l’étape de chromatographie échangeuse d’ions les fractions sont également étudiée par spectrophotométrie cette fois à 280nm afin de nous renseigner sur la quantité de protéine et d’identifier la fraction contenant notre protéine d’intérêt: la prothrombine. En effet celle-ci fait un pic d’absorbance étant donné qu’elle est présente en majorité. Ultérieurement on mesure l’activité enzymatique de cette fraction contenant la prothrombine.

I- Introduction

La thrombine ou facteur IIa est une enzyme protéolytique qui appartient à la famille des sérines protéases. Elle est bicaténaire c’est-à-dire qu’elle est