Purification du lysozyme

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  • Publié le : 12 novembre 2011
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TP n°1 : Purification du lysozyme

But : le but de ce TP est de purifier le lysozyme à partir d'un blanc d'œuf à

Principe : Afin de purifier le lysozyme, on réalise une chromatographie d'échange d'ions, à partir de la propriété basique de la protéine, en utilisant une résine de carboxyméthyl cellulose. Après l'avoir purifié, on vérifie cette purification grâce à la propriété enzymatiquedu lysozyme.

La chromatographie d'échange d'ions dépend de l'adsorption réversible de molécules chargées sur des groupes d'échangeurs d'ions immobilisés de charges opposées. Dans cette chromatographie, les ions sont liés par des interactions électrostatiques à un support insoluble et chimiquement inerte, remplacés de manière réversible par des ions en solution.

Le pH du tampond'équilibration est inférieur au pHi du lysozyme donc les protéines sont chargées positivement, alors que le pHi des autres protéines présentes dans le blanc d'œuf est inférieur au pH de ce même tampon. On utilise alors une résine de carboxylméthyl cellulose chargée négativement qui va alors retenir uniquement le lysozyme. Les autres protéines sont récupérées dans les fractions lors des différents lavages.A l'aide du tampon d'élution, dont le pH est sensiblement égal à la valeur du pHi du lysozyme, celui ci devient neutre, et est alors élué, et récupéré dans les éluats.

Spectrophotométrie : Pour doser une molécule, c’est-à-dire connaître sa concentration en solution, la solution est placée sur le trajet d’un rayonnement électromagnétique d’une longueur d’onde fixe telle qu’il peut êtreabsorbé par la molécule. Dans ces conditions, l’absorption est directement proportionnelle à la concentration de la molécule en solution. Cette relation de proportionnalité est énoncée par ma loi de Beer-Lambert : la transmission du REM à travers une solution est T = I/I0. Cependant c’est la densité (DO) ou absorbance qui est proportionnelle à la concentration de la molécule.
DO = log(1/T) = (LC

(est le coefficient d’extinction molaire, caractéristique de la substance, à la longueur d’onde choisie
L est le trajet optique, généralement égal à 1cm
C est la concentration de la substance à doser

Préparation des tampons
Tampon d'équilibration de volume final 250 mL dont la composition finale est NaCl 0,05 M et Tris-HCl 0,05 M à pH 8,2, à partir des solutions A et B.
A: NaCl 0,5M etB: Tris Hcl 0,5 M, pH 8,2
C= n/V
Vt= 250 mL
nA= 250 x 10 -3 x 0,05 = 1,25 x 10-2 moles

nB= 250 x 10 -3 x 0,05 = 1,25 x 10-2 moles

donc VA = nA/ CA = 1,25 x 10-2 / 0,5 = 2,5 x 10-2 l = 25 mL

et VB = nB/ CB = 1,25 x 10-2/ 0,5 = 2,5 x 10-2 l = 25 mL, à diluer dans 200 mL d'eau.

Tampon d'élution, de volume final 40 mL dont la composition finale est 0,2 M pH 10,5 de carbonate, àpartir des solutions A' et B'.
A': 0,2 M de carbonate de sodium et B': 0,2 M de bicarbonate de sodium de pH 10,3.

pH = pKa + log (B'/A')
10,5 = 10,3 + log (B'/A')
0,2 = log (B'/A')
et A' + B' = 0,2
B' = 0,2 - A'
1,585 A' = 0,2 – A'
A' = 0,2 / 2,585 = 7,74 x 10-2 M

VA'= 15,4 mL = 15 mL

VB' = 24,6 mL = 25 mL

|Fractions |Volume |Concentrationprotéique |Protéines totales |Activité enzymatique |
| |mL |mg.mL-1 |mg |U/aliquot |
|1 |20 |1,08 |1,9 |-0,0585 |
|2 |100 |1|1,9 |-0,0047 |
|3 |100 |1 |1,9 |0 |
|4 |100 |1 |1,9 |0 |
|5 |100 |1...
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