Purification prothrombine

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  • Publié le : 15 avril 2009
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I. Introduction :

La prothrombine, ou facteurII, est une chaine polypeptidique synthétisé dans le foie et intervenant dans le processus de la coagulation sanguine. Cette prothrombine est ensuite clivée en thrombine, ou facteur IIactivé (IIa), par le facteur Stuart activé ( Xa ) .
La thrombine est une glycoprotéine de la famille des sérine-protéases . Cette enzyme protéolytique bicaténaireest l'élément central du système de coagulation du sang.
La thrombine va alors permettre de transformer le fibrinogène en fibrine, d'activer les plaquettes par les récepteurs PAR et donc de permettre au sang de se coaguler.
Cette transformation de la prothrombine en thrombine peut aussi se faire grâce à un poison:

l'écarine, qui une fois injecté dans le sang va clivée le facteur II en facteurIIa et provoquer une importante thrombose.
Dans ce TP nous allons donc chercher à isoler (purifier) la prothrombine de deux manières différentes : par précipitation au BaCl2 et par chromatographie échangeuse d'ion . Nous allons ensuite essayer de déterminer l'activité enzymatique de la prothrombine transformé en thrombine, sous l'action de l'écarine et grâce à un substrat chromogénique.II. Matériel et méthodes :

'' précipitations au Chlorure de Baryum (BaCl2) :
ces précipitations consistent à isoler du reste du plasma les protéines de prothrombine grâce à des centrifugation successives et à l'ajout de BaCl2 . Chaque protéine est plus ou moins soluble en solution selon sa composition, on peut donc les séparer en fonction de leur tendance à précipiter plus ou moins vitequand on augmente la force ionique de la solution qui les contient. Après chaque ajout de BaCl2 et centrifugation une partie du surnageant sera prélevé ( S1 , S2) et le culot sera resuspendu dans une solution saline avant d'être réprécipité à nouveau ( C1 , C2 ).

'' chromatographie échangeuse d'ions :
cette étape consiste à fixer sur une colonne DEAE-Sephadex échangeuse d'ion les protéines;en effet cette colonne comprend des groupements diéthylaminoéthyl (DEAE) chargés positivement qui vont retenir les protéines quant à elles chargées négativement. Il va ensuite falloir laver la colonne grâce à un tampon «  doux »de trisodium sulfate (5ml) puis nous allons commencé à éluer la colonne à l'aide de se même tampon dont nous allons progressivement augmenter la concentration en Chlorure deSodium (NaCl) : 0,3M (5ml); 0,4M (5ml); 0,5M (10ml) .Cette augmentation progressive de concentration en NaCl va permettre d'éluer les protéines par rapport à leur affinité avec la colonne . Chaque millilitre de tampon de lavage et de tampon d'élution sera récupéré en sortie de colonne et analysé au spectrophotomètre.

Fig 1 : Principes de la chromatographie échangeuses d'ions

''Spectrophotométre :
Un spectrophotomètre UV-Visible est un appareil qui permet de mesurer l'absorbance d'une solution homogène à une longueur d'onde donnée. L'absorbance d'une solution sera proportionnelle à la concentration de la substance en solution, à condition de se placer à la longueur d'onde à laquelle cette substance absorbe les rayons lumineux ( pour déterminer le pic de prothrombine : 280nm ;pour mesurer l'activité de la thrombine : 400nm).
Le spectrophotomètre va aussi nous servir à déterminer l'activité de la thrombine en établissant un chromatogramme des différentes fractions d'intérêt mis en évidence au cours du TP . Pour cela nous rajouterons à nos fractions une substrat chromogénique, un tampon d'activité et de l'écarine .
Fig 2 : principes du spectrophotomètre
III.Résultats :

1. Chromatographie échangeuse d'ion : analyse au spectrophotomètre :
tabl 1 : absorbances des différentes fractions.

Après lavage et élution de la colonne, nous avons recueilli 25 fractions: les 5 premières fractions correspondent au 5ml de tampon de lavage ( n°1 à n°5), les 5 suivantes au 5 ml de tampon avec NaCl à 0,3M (n°6 à n°10), les 5 suivantes au 5ml de tampon avec...
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