Université I de Strasbourg – Faculté des Sciences de la Vie

Licence de Biochimie – Biologie Moléculaire

Année 2012 - 2013

Rapport de Travaux Pratiques

Présenté par MAKOWSKAYA Anna

PURIFICATION EN UNE ETAPE DE LA L-ASPARTATE AMMONIA-LYASE D’HELICOBACTER PYLORI PAR CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITE ET ETABLISSEMENT DU BILAN DE PURIFICATION

Résumé

Communément appelée aspartase (L-Aspartate ammonia lyase), l’AAL fait partie de la famille des lyases (EC 4.3.1.1). Elle catalyse la désamination réversible du L-aspartate en fumarate en participant au métabolisme des acides aminés chez les bactéries.
Le gène de l’AAL d’H. pylori (HP0649) a été amplifié par PCR avec une séquence His Tag et a servi pour transformer une souche d’Escherichia coli BL21-AI via le vecteur d’expression pET-15b. La conservation des clones positifs se fait sur un milieu gélosé LB additionné d’Ampicilline et Tétracycline. La surproduction de l’AAL par ces clones est obtenue par induction à l’IPTG à 0.5 mM.
L’aspartase a été purifiée par chromatographie d’affinité sur NiNTA-Sepharose. S’en suivent une analyse du poids moléculaire apparent par chromatographie d’exclusion de taille sur une colonne de SuperdexTM 200 par HPLC, et enfin une dialyse. L’analyse de chaque étape a été faite par SDS-PAGE et la concentration en AAL après chaque étape a été déterminée par cinétique enzymatique suivie par spectrophotométrie. On en tire un bilan de purification et une future stratégie expérimentale pour d’éventuelles analyses des propriétés biochimiques de l’AAL.

Introduction

Le L-aspartate est produit à partir de fumarate et d’ammoniac à l’aide de l’activité enzymatique de l’AAL. L-aspartate fumarate + NH3

Cette enzyme a été pour la première fois utilisée pour produire de l’acide L-aspartique par Tanabe Seiyaku Co., utilisant la