Separation de l'alanine et de l'arminien sur résine échangeuse d'anions

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  • Publié le : 4 décembre 2011
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TP 1 : SEPARATION DE L’ALANINE ET DE L’ARGININE SUR RESINE ECHANGEUSE D’IONS

1. BUT

Ce TP consiste à séparer deux acides aminés constitutifs d’un peptide : l’alanine et l’arginine par une hydrolyse puis par chromatographie sur échangeuse d’ions, puis d’effectuer le dosage de l’alanine et la mise en évidence de l’arginine.

2. PRINCIPES



Nous réaliserons pour commencer le TP,l’élution de l’alanine afin de pouvoir la doser.

La chromatographie échangeuse d’ions est un type de chromatographie en phase liquide permettant d’isoler une substance chargée électriquement d’un mélange de molécules chargée (liquide).
Elle est composée de deux phases :
* Phase stationnaire : l’amberlite IRC 50
* Phase mobile : le tampon acétate 0,1 mol/L pH 4,2 faisant migrer les acidesaminés.
On fait passer le mélange sur une phase stationnaire solide (résine échangeuse d’ions) chargé déjà associé à des ions connus, et on remplace ces ions par les ions/molécules chargés du mélange à chromatographier.
Ici la résine échangeuse d’ions est l’amberlite IRC 50 qui possèdent un groupement carboxylique, c’est donc un échangeur de cations qui retiendra les acides aminés sous leur formecationique. De plus le pH de la solution étant fixé (4,2), si la charge des acides aminés est nulle voire négative devant le pH, ils seront peu ou pas retenus, au contraire si leur charge est positive ils seront retenus (pH du tampon inférieur au pHi des acides aminés). L’élution pourra ensuite être réalisée en augmentant le pH du tampon.

Son dosage repose sur l’apparition d’une couleur pourpredue à la condensation de NH3, libéré par l’acide aminé, et d’une molécule de ninhydrine et d’hydrindantine. Apres préparation des différents tubes pour l’analyse, nous effectuerons une lecture de l’absorbance, mesurée par un spectrophotomètre. Plus l’espèce est concentrée plus elle absorbe la lumière dans les limites de proportionnalités. Il faut donc au préalable déterminer la longueur d’onded’absorption de l’espèce chimique à étudier.

Concernant la mise en evidence de l’arginine, il s’agit d’une réaction spécifique où en présence d’alpha-naphtol et d’hypobromite de sodium en milieu alcalin, l’arginine donnera une coloration rouge orangé.



3. MODE OPERATOIRE

Notre mélange à chromatographier est le mélange B.

Pour préparer 10 mL de la solution standard d’alanine à 20g.mL-1 à partir de la solution mère à 80 mg.200 mL-1 :
80mg / 200mL 0,4mg / mL 400g / mL
Sachant que notre solution doit être à 20g / mL, il nous suffit de trouver le facteur de dilution : 400g / 20g = 20 le facteur de dilution est 20.
1mL / 20 = 0,05mL
On veut 10mL de cette solution : 10mL / 20 = 0,5mL
On a donc pipeté 0,5mL de notre solution mère, que l’on adiluée en ajoutant 9,5mL d’eau distillée.
Les 10mL de la solution standard à 20 g.mL-1 vont être utilisés pour la gamme étalon.



Lors de la préparation du réactif à la ninhydrine, on ajoute les 3mL de tampon acétate 4 mol.L-1 pH 5,5 seulement au dernier moment, car lorsque l’on va l’ajouter, le réactif va réagir, et si on le laisse agir trop longtemps, le réactif censé colorer lasolution en jaune, va de plus en plus se décolorer jusqu’à perdre sa coloration. Sans la coloration, les mesures d’absorbance au spectrophotomètre sont impossibles.



Pour la mise en évidence de l’arginine, on nous demande de préparer 10mL d’-naphtol à 0,1% , ce qui équivaut à une concentration de 0,1g / 100mL, dans un mélange éthanol-eau dans les proportions 50:50.
0,1g / 100mL 0,01g/ 10mL 10mg / 10mL
On va donc peser 10mg d’-naphtol que l’on va dissoudre dans 10mL du mélange éthanol-eau (50:50).

4. RESULTATS ET DISCUSSION

Gamme étalon :

Tubes | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
Alanine 20g/mL mL | 0 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1 | | | |
Eau distillée mL | 1 | 0,8 | 0,6 | 0,4 | 0,2 | 0 | | | |
Réactif ninhydrine...
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