TP de Biologie Moléculaire
Séparation d’ADN par électrophorèse analytique et préparative

Objectif

L’objectif de ce TP est de préparer et d’extraire l’ADN plasmidique pUC18-wzc à partir d’une souche d’E.coli pour établir une carte de restriction, puis de réaliser une électrophorèse en gel d’agarose afin d’isoler le fragment Eco RI/
Bam HI (wzc).

Principe

Préparation de l’ADN plasmidique

La préparation de l’ADN plasmidique est réalisée à partir d’une souche d’E.coli cultivée à 37°C dont le milieu de culture est éliminé par centrifugation. Le culot bactérien obtenu est ensuite resuspendu dans une solution I qui contient entre autres de l’EDTA et du lysozyme. L’EDTA permet de chélater les cations divalents (Mg2+ et Ca2+) afin d’éviter l’activation des DNases, et le lysozyme permet la digestion des parois bactériennes en coupant les liaisons du peptidoglycane.
On ajoute ensuite la solution II contenant du NaOH qui augmente le pH et dénature l’ADN chromosomique. L’ADN plasmidique, super enroulé au départ, se retrouve sous sa forme relachée. La dernière solution utilisée (solution III) contient de l’acétate de potassium qui permet un retour aux conditions acides. Il permet l’agrégation des chaînes dénaturées (elles ne peuvent plus se renaturer) et l’ADN plasmidique se renature.
Les particules insolubles telles que l’ADN chromosomique et les protéines sont éliminées par centrifugation afin de récupérer le surnageant.
On utilise ensuite un mélange phénol/chloroforme/alcoolisoamylique. Le phénol permet d’éliminer les protéines résiduelles, le chloroforme élimine les traces de phénol, et l’acoolisoamylique est un anti-moussant.
Enfin, on utilise de l’éthanol pour faire précipiter l’ADN plasmidique.
Un gel d’électrophorèse sur gel d’agarose à 1% est réalisé pour contrôler la préparation.

Etablissement de la carte de restriction de pUC18-wzc

Pour réaliser la carte de restriction du plasmide pUC18-wzc, on utilise plusieurs enzymes de