Séquençage

Intro

– 1953 La structure en double hélice de l’ADN est établie par James D. Watson and Francis Crick
– 1958 L’expérience de Meselson-Stahl démontre que l’ADN est répliqué de façon semi-conservative
- 1977 Séquençage d'ADN (W Gilbert, F Sanger)
- 1986 Première publication publique sur la PCR par Kary Mullis (prix Nobel de chimie en 1993)
- 1984 Séquence du virus d'Epstein-Barr, 170 kb
- 1987 Séquenceurs automatiques (L Hood)
- 1995 Séquence complète de Haemophilus influenzae (C Venter, TIGR)
- 1996 Séquence complète de la levure
- 1997 Escherichia coli
- 2000 Arabidopsis thaliana; Drosophila melanogaster (Venter, TIGR)
- 2004 Homo sapiens, séquence complète (Human Genome Program)

Qu'est ce que le séquençage d'ADN?
Une méthode permettant d'obtenir la séquence complète d'un fragment donné d'ADN.
Pourquoi réaliser un séquençage?
Pour connaître l’enchaînement complet des bases nucléotidiques qui constituent un génome.

1. Méthodes de séquençage traditionnelles : méthode de Sanger et de Maxam et Gilbert

Deux méthodes ont été développées en même temps en 1977 mais avec deux approches différentes qui ont étés toutes deux récompensées par un prix Nobel en 1980.

1.1 Méthode de Sanger

La méthode de Sanger se base sur une approche de synthèse enzymatique sélective (arrêt de l'élongation) via l'utilisation de didésoxyribonucléotides (ddNTP), en plus de dNTP qui ont pour principale caractéristiques d'avoir des groupements hydroxyles remplacés par des H ce qui empêche l'action de la polymérase.
Après clonage et obtention de nombreuses molécules d'ADN simple brin, des dNTP marqués en fonction de leur base (exemple de nucléotide à Cytosine) sont mis en présence de ddNTP (de Guanosine) dans le milieu, la synthèse du brin complémentaire au brin matrice débute à partir d'une amorce associée au brin matrice. Les dNTP sont ajoutés au hasard par la polymérase suivant la complémentarité des bases jusqu'à l'ajout en bout de chaine