Titrage d’un sérum de lapin par ELISA

Le but de ce TP est de mettre en évidence, dans le sérum d’un lapin préalablement immunisé par la BSA, la présence d’anticorps spécifiques anti-BSA et de titrer la réaction par la technique de l’ELISA.

Le TEST ELISA :

L’ELISA est un test qui permet d’analyser les réactions antigène / anticorps.

Pour réaliser ce test on utilise une plaque de microtitrage ELISA composés de 96 puits à fond plat. On va venir fixer sur celle-ci l’antigène.

Cette technique utilise deux anticorps, le premier est spécifique de l’antigène et l’autre reconnait le complexe immun et est couplé à une enzyme qui en dégradant son substrat donne un résultat coloré qui va permettre par observation au spectrophotomètre de quantifier le nombre d’anticorps fixés.

Tout d’abord on « coate » la plaque avec l’antigène ici le BSA.

Ensuite on recouvre les puits avec le sérum que l’on veut tester ici le sérum de lapin immunisé par la BSA. On fait aussi des contrôles en laissant des puits « blanc » et en testant du sérum normal de lapin. Dans certains puits on ajoute une solution acide et une autre basique puis du SDS (qui va donner une charge uniformément négative) et du NP40 un détergent ionique.

Pour les différents sérums on fait des dilutions afin de vérifier que la détection soit bien proportionnelle.

Le sérum immunisé HI va être purifié par chromatographie d’affinité utilisant l’interaction anticorps/antigène ; les fractions F1 à F4 issues de cette purification vont-elles aussi être diluées et déposées dans les puits « coatés » par la BSA.

PRINCIPE :

1ère étape : « coaetage » des puits avec l’antigène ici BSA

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On met l’antigène en excès pour éviter d’avoir des trous sur les puits qui engendreraient une fixation non spécifique des anticorps sur le plastique qui est très fixant, cela fausserait les résultats.

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Il est également nécessaire de déposer une grande quantité