Titrage d'un serum de lapin par elisa

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  • Publié le : 1 avril 2011
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Titrage d’un sérum de lapin par ELISA

Le but de ce TP est de mettre en évidence, dans le sérum d’un lapin préalablement immunisé par la BSA, la présence d’anticorps spécifiques anti-BSA et de titrer la réaction par la technique de l’ELISA.

Le TEST ELISA :

L’ELISA est un test qui permet d’analyser les réactions antigène / anticorps.

Pour réaliser ce test on utilise une plaque demicrotitrage ELISA composés de 96 puits à fond plat. On va venir fixer sur celle-ci l’antigène.

Cette technique utilise deux anticorps, le premier est spécifique de l’antigène et l’autre reconnait le complexe immun et est couplé à une enzyme qui en dégradant son substrat donne un résultat coloré qui va permettre par observation au spectrophotomètre de quantifier le nombre d’anticorps fixés.

Toutd’abord on « coate » la plaque avec l’antigène ici le BSA.

Ensuite on recouvre les puits avec le sérum que l’on veut tester ici le sérum de lapin immunisé par la BSA. On fait aussi des contrôles en laissant des puits « blanc » et en testant du sérum normal de lapin. Dans certains puits on ajoute une solution acide et une autre basique puis du SDS (qui va donner une charge uniformément négative) etdu NP40 un détergent ionique.

Pour les différents sérums on fait des dilutions afin de vérifier que la détection soit bien proportionnelle.

Le sérum immunisé HI va être purifié par chromatographie d’affinité utilisant l’interaction anticorps/antigène ; les fractions F1 à F4 issues de cette purification vont-elles aussi être diluées et déposées dans les puits « coatés » par la BSA.PRINCIPE :

1ère étape : « coaetage » des puits avec l’antigène ici BSA

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On met l’antigène en excès pour éviter d’avoir des trous sur les puits qui engendreraient une fixation non spécifique des anticorps sur le plastique qui est très fixant, cela fausserait les résultats.

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Il est également nécessaire de déposer une grande quantité d’antigèneafin de pouvoir cribler un maximum d’anticorps.

Ensuite on lave afin de se débarrasser de tout ce qui n’a pas été fixé.

2ème étape : On ajoute le sérum HI et on laisse le temps aux interactions de se faire.

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Puis on relave afin d’éviter qu’il reste des anticorps non liés. Ceux-ci pourraient être reconnus par les anticorps secondaires ce qui fausserait ladétection.

3ème étape : On dépose des anticorps secondaires couplés à une enzyme.

-Les anticorps secondaires peuvent être plusieurs à se fixer sur un même anticorps primaire ce qui va permettre d’amplifier le signal.

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-L’enzyme liée à l’anticorps secondaire a la particularité de donner un produit coloré après dégradation de son substrat( il faut donc donner à cette enzyme dusubstrat pour pouvoir obtenir une coloration et titrer la réaction.

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Dans ce TP nous utiliseront comme enzyme la phosphatase alcaline qui va dephosphoryler son substrat et le rendre coloré.

4ème étape : Une fois le substrat ajouté il faut recouvrir la plaque de papier d’aluminium afin de protéger les puits de la lumière avant de placer la plaque dans le spectrophotomètreet de mesurer les absorbances.

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Méthodes de l’expérimentation

- Les moyens et les réactifs

On veut mettre en évidence les anticorps contenu dans du sérum de lapin, on utilise pour cela une technique immuno-enzymatique : l’ELISA. On réalise plusieurs étapes successives.

Tout d’abord il est nécessaire de sensibiliser les puits avec de l’antigène : laBSA (Albumine Sérique Bovine) . Il est important que l’antigène soit en excès, en effet il doit recouvrir toute la surface du puits. S’il n’y en a pas assez, il risque d’y avoir des liaisons non spécifiques avec le fond du puits.

On lave ensuite la plaque contenant les puits afin de ne conserver que l’antigène qui a été fixé. On ajoute le sérum contenant les anticorps anti-BSA et on lave de...
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