ALCOOL DESHYDROGENASE

Cette enzyme, extraite de la levure de bière, catalyse la réaction suivante :

C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH + H+

Dans cette équation, l’éthanol est le substrat et le NAD+ joue le rôle de coenzyme.
Le relargage d'ions H+ dans le milieu nécessite l'emploi d'un tampon. Si l'on se place en phase de vitesse initiale on peut négliger le sens 2 de la réaction.
N.B. : NAD+ nicotinamide adénine dinucléotide.
Dès votre arrivée, il convient de préparer très soigneusement les solutions dont vous aurez besoin (calculer les volumes au plus juste et les indiquer à l’enseignant avant de préparer les solutions).

Solutions à préparer :
1° - Solution mère d'enzyme :
6 mg d'enzyme lyophilisée dans 4 ml d'eau distillée.
2° - Solution tampon : glycine - pyrophosphate de sodium pH9 - 75mM :
Na4P2O7, 10H2O (10 g)
Glycine (0,5 g)
Ajouter 250 ml d'eau distillée ; ajuster à pH9 avec HCl 1M. Ajuster le volume final à 300 ml.
3° - Solutions ayant pour rôle de stabiliser l'enzyme :
a) Solution de chlorhydrate de semicarbazide : 2,2M
Chlorhydrate de semicarbazide (5 g)
NaOH 2M (20 ml)
Ajuster à pH 6,3-6,5 (viser la valeur 6,4 au pHmètre) avec NaOH 5M.
b) Solution de NAD+ :
Dissoudre NAD+ dans de l'eau distillée : 20 mg/ml.
c) Solution de glutathion : 300mM
Glutathion dans de l'eau distillée : 90 mg/ml.
d) Solution d'albumine :
Albumine dans de l'eau distillée : 100 mg/100 ml.
4° - Solution enzymatique à utiliser pour les expériences :
1 ml de la solution mère d'enzyme ajouté à 200 ml de la solution d'albumine. Conserver cette solution dans de la glace fondante.

MATERIEL : Au cours de vos manipulations, vous utiliserez un spectrophotomètre très coûteux, veillez à ne rien casser et à ne rien souiller.

TEST D'ACTIVITE PREALABLE
Mettre dans chacune des deux cellules du spectrophotomètre :
*** solution tampon (2,5 ml)
*** solution de chlorhydrate de semicarbazide (0,1 ml)
*** éthanol pur (0,1 ml) (M = 46, densité : 0,81)
*** solution