Tp albumine

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  • Publié le : 13 novembre 2011
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TP – Séparation de l’albumine du sérum par chromatographie d’affinité

I) But
Le but de ce TP est l’extraction de l’albumine du sérum humain.
II) Principe
On effectue pour cela une chromatographie d’affinité. Le sérum est déposé dans une colonne à chromatographie contenant une résine de Bleu Sépharose CL-6B, spécifique à l’albumine, et est élué à l’aide de 2 tampons différents. Lors dulavage, où l’on utilise le tampon A, les protéines non spécifiques ne sont pas retenues dans la résine et sont éliminées, tandis que l’albumine est adsorbée spécifiquement sur le ligand, ici la résine de Bleu Sépharose. Pour l’élution, on utilise le tampon B qui est de l’acide chlorhydrique. Ce composé a une grande force ionique, et va saturer le milieu : c’est le phénomène de salting out, et permetd’éluer l’albumine fixée sur la résine. Le collecteur est programmé pour distribuer 1,5mL dans chaque tube, de manière à avoir le même volume dans les tubes contenant l’éluat que dans la gamme étalon contenant la solution mère d’albumine bovine, pour que les résultats soient interprétables.
Afin de déterminer la concentration d’albumine dans le sérum, on réalise une gamme étalon ainsi qu’un profild’élution. On utilise une solution mère d’albumine bovine (SMA) dont la concentration est connue, et on en introduit différents volumes dans des tubes à essai, de manière à avoir plusieurs concentrations de cette solution. On réalise également deux tubes témoins pour les tampons B et A, qui correspondent respectivement aux tubes 8 et 9. Le tube 1, qui ne contient que de l’eau distillée et du biuret,est un témoin négatif.
De cette manière, en effectuant un dosage spectrophotométrique de cette gamme étalon ainsi que des échantillons récupérés par le collecteur, on peut calculer la concentration en albumine dans la solution de départ par des méthodes graphiques, car l’absorbance est proportionnelle à la concentration, comme on peut le voir dans la relation : A= ε × l ×c, avec A= absorbance, ε=coefficient d’extinction molaire, et c la concentration.

Pour pouvoir mesurer l’absorbance, on a rajouté du biuret dans les tubes dont on veut calculer la concentration. En effet, le biuret est une molécule composée de CuSO4, EDTA disodique et de KCl. Elle se fixe sur les molécules, en formant un complexe coloré, et permet ainsi de mesurer la concentration de la substance. La structure ducomplexe formé est la suivante :

On a ensuite réalisé une électrophorèse avec les fractions les plus concentrées où il n’y a pas eu de biuret ajouté pour chaque type de solution obtenu. On ne peut pas prendre les tubes ayant reçu du biuret car celui-ci dégrade les protéines, on choisit donc les tubes les plus concentrés n’ayant pas reçu de biuret. Le dépôt est fait sur le pôle moins, et les protéinesvont migrer vers plus ou moins loin vers le pôle positif en fonction de leur charge et de leur masse.

III) Résultats
Gamme étalon :
Les mesures d’absorbances de la gamme étalon sont données dans le tableau suivant :
Tube Quantité d’albumine (mg) Absorbance lue Absorbance réelle
1 0 0.0167 0
2 0.8 0.0405 0.0238
3 2 0.0686 0.0519
4 2.8 0.0899 0.0732
5 4 0.1199 0.1032
6 5.2 0.1542 0.13757 6 0.1748 0.1581
8 0.1095
9 0.1119

La courbe étalon tracée à partir de ce tableau est donnée en annexe.

Gamme d’élution :
Une fois l’élution terminée, les mesures d’absorbance ont été effectuées. Les résultats de ces mesures effectuées directement sur la moitié des tubes sont donnés dans ce tableau :
Tube A lue A lue– A tube n°1
2 0,1171 0,1004
4 0,2139 0,1972
6 0,1146 0,09798 0,0509 0,0342
10 0,0463 0,0296
12 0,0658 0,0491
14 0,1578 0,1411
16 0,0803 0,0636
18 0,0471 0,0304
20 0,0403 0,0236

Le profil d’élution tracé à partir de ce tableau est donné en annexe.
On remarque que ces valeurs d’absorbance sont relativement faibles, notamment pour les tubes 10 à 20 qui contiennent le tampon B. Ces valeurs sont même plus faibles que le tube témoin pour le...
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