Tp bio 03

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  • Publié le : 22 novembre 2011
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Titrage de caséines et calcul du nombre de tyrosines
présentent dans le lait.

Résumé:

On utilise du lait (20ml) auquel on ajoute de l'acide acétique ( 0,2mol/l), puis on recupère le précipité par centrifugation. on procede ensuite à deux lavages avec de l'éthanol à 70% puis à 95% et on recupère le culot.Après séchage on effectue une pesée du culot ou l'on obtient 0,61g/20ml de(soit 31g/l) résultat ne concordant pas avec celui attendu de 28g/l de caséine.On en déduit donc la présence d'autres molécules précipités en meme temps que la caséine.

Abréviations
pHi: pH isoéléctrique
aa: acide aminé

Introduction

Les protéines sont un élément essentiel du monde du vivant. On en retrouve en particulier dans le lait ou la nourriture. Afin de pouvoir étudierces protéines et en analyser certaines propriétées il est nessecaire de les isolés des autres constituants.Nous allons nous interesser à une protéine particulière et largement présente dans le lait: la caséine (80% de la masse protéique).
Pour extraire cette protéine nous allons nous basé sur les propriétés électriques des molécules et donc des acides aminés, et nous chercherons à atteindre lepoint isoéléctrique de la caséine.
(cf. Partie 1- Précipitation des caséines)
En effet, à un certain ph ,une molécule donnée devient électriquement neutre (point isoélectrique), or le but de cette manipulation étant d'établir un titrage de tyrosine contenue dans la caséine du lait dont on sait que pHi=4,6 l'ajout d'acide acétique permet d'atteindre ce niveau de pH, permettant la précipitationdes molécules de caséine qui sont devenue électriquement neutre.Une fois extraite et purifiée on va quantifier le nombre de caséine par pesé du culot sec obtenu.
nous allons ensuite quantifier la concentration en caséine à partir du dosage des tyrosines d'une solution de caséine purifiées et hydrolysées que l'on trouve dans le commerce;
Pour quantifiés la concentration en protéine d'une solutionon peut doser la quantité en acide aminés libre de cette solution. Ici un aa facile à doser est la tyrosine qui est un constituant de la caséine qui contient 3 molécules de tyrosine ( acide aminé de la caséine) . Cependant on ne peut effectuer un dosage uniquement sur les molécules de tyrosine libres dans la solution (soit ici environ 40% d' aa libres dans la solution), celles étant partiellementhydrolysées n'étant pas accessible pour le dosage que nous allons effectuer par Colorimétrie ou réactif utilisé et le réactif de Folin Ciocalteu qui est réduit en milieu alcalin par le noyau phénolique des résidus de tyrosine libre, donnant une coloration bleue.
Afin de mener à bien ce titrage, la création d'une courbe d'étalonnage est necessaire. On utilisera pour ce point une solution detyrosine pure.
(cf. II-Détermination de la concentration en caséine à partir du dosage de la tyrosine)
Pour finir nous allons déterminer la composition en acides aminés de petits peptides obtenue apres hydrolyse. Pour ce faire des tri-peptides provenant de la solution de caséines hydrolysée (cf partie II) on eté isolés et nous allons utilisé la technique de chromatographie de partage afin dedeterminer leurs composition en aa à partir d'une gamme d'aa isolés que nous allons faire migrer en même temps. Cependant bien qu'utilisé fréquement pour determiné la composition en aa d'un peptide, cette méthode n'est pas utilisée pour le séquencage d'une protéine complete.
(cf. III-Séparation par chromatographie de partage, d'acides aminés provenant d'hydrolysat de caseines).

Resultats:I-Précipitation des caséines

NB: Pour cette partie nous prendrons les resultats obtenus par David Lecocq, ceux de Amel Ouhadda étant fossés apres que le tube contenant la solution de lait écrémé et d'acide acétique ne ce soit percé lors des manipulations.
Après exctraction et purification du précipité on obtient 0,62g de culot sec.
A partir de notre quantité on calcule la concentration massique :...
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