Tp bio 57

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  • Publié le : 16 novembre 2011
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Résumé

Introduction: Le clonage, apparu dans notre société voilà 50 ans, est très présent dans l'actualité, souvent présenté par les médias sous un aspect négatif, et donnant lieu à de nombreuses polémiques. La notion de clonage recouvre un ensemble de techniques permettant d'obtenir la réplication à l'identique d'une cellule ou d'un organisme. La population obtenue est constituée decellules ou d'organismes possédant tous le même patrimoine génétique, cet population forme un clone . Dès le début du XXe s., des cultures de tissus d'animaux et de végétaux ont été tentées. La culture de peau humaine est aujourd'hui pratiquement maîtrisée. Mais le sujet de ce TP aborde un clonage différent de celui présenté et critiquer dans les média. Il s'agit du clonage de molécules d'ADN du phagelambda dans un vecteur de clonage.

Les vecteurs de clonages sont des plasmides et possèdent tous des caractéristiques communes. Ils ont une origine de réplication qui leurs permet de se répliquer de manière autonome, un ou plusieurs gènes de résistance a un antibiotique pour la sélection des plasmide ayant intégrés le vecteur ou non, ainsi qu'une région possédant des sites de restrictionsuniques pour différents enzymes de restrictions. La plasmide utilisé dans cette expérience est le pBlueScript, il possède des sites de coupure unique pour 7 enzymes de restrictions dont EcorI et HindIII, ainsi qu'un gène de résistance à l'ampiciline. Le gène de résistance permet à une culture en présence d'ampicilline de sélectionner toutes les bactéries ayant incorporés BlueScript, que ce BleuScriptcontienne ou non l'insert ( le fragment d'adn phage lambda).
Les enzymes de restrictions sont des endonucléases d'origine bactérienne et de véritables 'outils' utilisés en laboratoire pour pouvoir fragmenter l'adn. La coupure se fait en un site particulier reconnu par l'enzyme de restriction. Les séquences de nucléotides habituellement reconnues par les enzymes sont nommées « palindromes »exemple: radar.
Le plasmide et l'adn phage lambda vont être digérés par EcorI et HindIII. Lorsque l'adn phage lambda est digéré, il va se fragmenter en 13 morceau, seulement 8 pourrons etre utilisé pour le clonage, ce seront les fragments qui auront un coté EcorI et de l'autre HindIII. Ensuite, l'adn phage lambda va être inséré dans le plasmide. On réintègre le plasmide dans la bactérie qui va semultiplier, l'adn phage lambda nommé insert va donc aussi se multiplier. Des cultures de bactéries sont faisables, ce qui va donner des centaines de milliers d'exemplaires du plasmide. C'est le principe du clonage.

Résultats: A la suite de notre premier clonage une première électrophorèse sur gel d'agarose a été réalisé. En parallèle de la migration des fragments d'adn, un marqueur et introduitdans électrophorèse afin de déterminer la taille des fragments obtenus à l'issue de la digestion. Pour le plasmide on retrouve les taches a la bonnes taille, on voit une dizaine de taches
Pour ce qui est de l'ADN on ne voit aucune tache. (photo1)
Ensuite les bactéries transformées ont été étalés sur des boites de Pétri contenant du milieu de culture contenant de l'ampicilline. En effetl'ampicilline a pour fonction de tuer les bacteries qui n'ont pas intégrés le plasmide. Pour la boite L1, il ya un tapis de cellule. Pour la boite L2 il y a des colonies blanche et quelque colonies bleu. Pour la boite L3 il n'y que quelque colonies bleu.
Pour l'électrophorèse faite le deuxième jours l'analyse des fragments à l'issue de la digestion du plasmide purifié, il y a une tache a 3kb pour le pbs,le 3 et le 8b. Il y a une deuxième tache pour le 3 et le 8b.

Discussion
Électrophorèse 1 a été réalisé a la suite de la ligation de l'insert ( fragment de phage lambda) dans le vecteur de clonage ( plasmide pBleuScript). L'électrophorèse est faite avec un gel d'agarose. Ce gel sert a séparer les fragments testés. La migration se fait en position horizontale. Les fragments vont être séparés...
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