Tp chaine respiratoire

Disponible uniquement sur Etudier
  • Pages : 9 (2205 mots )
  • Téléchargement(s) : 0
  • Publié le : 19 avril 2011
Lire le document complet
Aperçu du document
Compte Rendu TP
ETUDE DE LA CHAÎNE RESPIRATOIRE

Principe

Le but de ce TP est d'étudier le fonctionnement de la chaîne respiratoire de mitochondries. Le foie étant un tissu particulièrement riche en mitochondrie, nous l'utiliserons pour cette étude. Pour comprendre le fonctionnement de la chaîne respiratoire, nous utiliserons un oxygraphe pour suivre l'évolution de la concentration enoxygène au cours du temps.
La chaîne respiratoire est localisée dans la membrane interne mitochondriale. Cette chaîne de transport d'électrons est constituée de quatre complexes enzymatiques :
• complexe I : NADH déshydrogénase
• complexe II : succinate déshydrogénase
• complexe III : cytochrome b-c1
• complexe IV : cytochrome c oxydase.

La chaîne respiratoire permet de réoxyder lescoenzymes NADH et Ubiquinone réduits au cours du cycle de Krebbs. Cette réoxydation s'accompagne de la création d'un gradient transmembranaire de protons qui va servir à fabriquer de l'ATP, molécule énergétique universelle.
Matériel et méthodes

• Préparation de la suspension mitochondriale
Dans ce TP, on utilise des mitochondries fraiches extraites à partir d'un rat récemment décapité. Aprèsune série de centrifugation, on récupère le culot qu'on suspend dans un tampon.

• Manipulations
Pour ces expériences, on utilise un oxygraphe. Il s'agit d'un appareil de mesure qui utilise une électrode à dioxygène constituée par une cathode et une anode reliée par une solution conductrice. L'ensemble est séparé du milieu par une membrane imperméable à l'eau et aux ions mais perméable audioxygène dissout. L'électrode est polarisée. On enregistre le courant électrique généré. L'intensité du courant est proportionnelle à la quantité d'oxygène dissoute dans le milieu. On peut ainsi suivre la consommation d'oxygène qui est l'accepteur final de la chaîne respiratoire. Grâce aux tracés obtenus nous pourrons calculer la pente et donc en déduire la vitesse de la réaction.

Dans ce TP, nousallons réaliser 5 tracés différents. Pour chaque tracé, on utilise un tampon de respiration, de la suspension de mitochondries et de l'ADP. Cependant, on injectera d'autres substances différentes dans le but d'étudier leur action sur la chaîne respiratoire.
Dans les tracés 1 et 2, nous étudierons l'effet de deux substrats : le Succinate et le Glutamate-Malate.
Pour les 3 autres tracés, nousdétermineront le rôle de différentes substances sur les complexes enzymatiques.

Exploitations des résultats
• 1er tracé
Composition : tampon de respiration (1,5 mL), suspension de mitochondries (10µL), succinate (10µL) et ADP (8µL) en 2 additions.

• Après ajout de succinate
On observe une augmentation de la consommation d’oxygène ; en effet, la pente du tracé augmente. Le succinate étantle substrat du complexe II, il va être oxydé par l’enzyme succinate déshydrogénase et être transformé en fumarate selon la réaction :
Succinate + FAD Fumarate + FADH2
Lors de cette oxydation, on constate que le FAD est réduit en FADH2, ceci libère 2 électrons. Ces derniers, seront utilisés par les complexes III et IV, pour faire apparaitre une molécule d’eau (H2O).
½ O2 + 2 e-+ 2H + H2O.Le succinate permet l’apport en électrons aux complexes II et III, ceci engendre l’activation du complexe IV et donc la consommation en oxygène par ce dernier.

• Premier ajout d’ADP
Lors de l’injection, on constate une chute de la pente du tracé, ce qui correspond à une augmentation de la consommation en O2. En effet, ceci nous prouve que les complexes I, II, III, IV et plus particulièrementle V sont fonctionnels. Au niveau du complexe V, l’ADP est transformé en ATP par la réaction de phosphorylation oxydative qui fait entrer des protons dans la matrice mitochondriale : ADP + Pi ATP
A ce moment là, le tracé se divise en deux phases :
• Une phase d’accélération de consommation d’O2 (état 3) qui correspond à la réaction de phosphorylation oxydative.
• Une...
tracking img