Tp clonage

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HARDY David ROCCHETTI Loïs BCMP 1

Amplification de l’ADNc Tyrosine Amino Transférase (TAT) de Rat, par PCR et son sousclonage dans le vecteur d’expression pGEM-T

Amplification de l’ADNc Tyrosine Amino Transférase (TAT) de Rat, par PCR et son sous-clonage dans le vecteur d’expression pGEM-T.
I) Introduction :

L’objectif de ce Tp est de sous cloner l’ADNcomplémentaire à l’ARNm codantpour la Tyrosine Amino Transférase de Rat. Pour cela, l’ADNc sera inséré dans un plasmide et pourra donc être transcrit in vitro en ARN qui sera utilisé comme sonde pour étudier l’expression du gène TAT.

A

A

Souche ayant intégré le plasmide non recombinant, elle est résistante à l’ampicilline et possède, la partie NH2terminale au niveau du plasmide et C terminale au niveau de l’ADNbactérien, de la protéine βGalactosidase. Cette souche pourra dégrader le X-Gal en Gal+X(de couleur bleue)

Souche ayant intégré le plasmide recombinant, elle est résistante à l’ampicilline. Elle ne possède pas la partie codant pour la partie NH2 terminale de la βGalactosidase. Cette souche ne pourra pas dégrader le XGal en Gal+X(de couleur bleue)

Souche ayant intégré le plasmide recombinant maisl’insert est inversé, elle est résistante à l’ampicilline. Elle ne possède pas la partie codant pour la partie NH2 terminale de la βgalactosidase. Cette souche ne pourra pas dégrader le X-Gal en Gal+X(de couleur bleue).De plus, cette souche ne pourra pas être utilisée pour synthétiser la sonde ARN car elle ne contiendra pas l’ORF.

Figure1 : Protocole expérimental

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II)

Amplification deL’ADNc TAT par PCR :

Le principe de la Polymerase Chain Reaction est d’obtenir en grande quantité un fragment d’ADN précis. Pour cela il faut un fragment d’ADN de base (celui que l’on veut dupliquer), des nucléotides (dNTPs), des amorces choisies pour amplifier que la partie qui nous intéresse, une ADN polymérase (ici la Taq polymérase isolé de la bactérie thermophilus aquaticus résistante à de hautestempératures) et des cofacteur de l’ADN polymérase (MgCl2…). Le mécanisme est le suivant : 5’ 3’
ATG STOP

3’ 5’

Dénaturation 30 sec à 94°C

Amorce 1 Amorce 2

Hybridation des amorces 30sec à 58°C

X30

Synthèse 1min à 72°C

Figure 2 : Schéma de la PCR Après ces 30 cycles, un cycle de synthèse complète et d’addition de A en 3’OH est fait à 72°C pendant 4 minutes puis un cycled’arrêt à 25°C pendant 30 secondes. III) Purification de l’ADNc TAT après PCR : Après la PCR, une purification est faite grâce à un kit « PCR Clean-Up Système » qui permet la fixation de l’ADN sur une membrane de silice et ainsi d’éliminer l’excès de nucléotides et d’amorces par différents lavages. ADN+produits de PCR L’ADN va rester au niveau de la membrane de silice et sera décroché une fois leslavages effectués grâce à de l’eau à 55°C.

Cette purification est suivie d’une évaluation, sur gel d’agarose, de la quantité d’ADNc TAT purifié. Pour cela un gel d’agarose est préparé selon les volumes suivants : Bromure d’éthidium(Bet) 0.8µL 80mL 4µL Volumes Tableau I : Composition du gel d’Agarose Le Bet est un agent intercalant qui va se fixer entre les bases de l’ADN et va nous permettre de voir(aux UV) où a migré le contenu du puit. L’ADNc purifié des différents groupes est déposé dans chaque puits ainsi qu’un marqueur de taille. Gel d’agarose 1% Tampon TAE (1X)

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Les résultats de l’électrophorèse sont les suivants : Marqueur de taille
T – témoin négatif sans ADNc

ADNc

1000bp/100ng

Figure 3 : Electrophorèse de la purification d’ADNc Le marqueur de taille (smart loader)permet généralement de faire une droite de régression et ainsi en reportant la distance à laquelle a migré l’échantillon de connaître sa taille. Or, ici, nous avons déjà estimé grâce à la séquence de l’ADNc de la TAT, la taille de l’ADNc purifié. Cette taille estimée est de 1173pb. Sur l’électrophorèse on peut voir que la bande correspondant à l’ADNc purifié est juste au dessus de la...
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