Tp enzymologie

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  • Publié le : 22 février 2013
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UNIVERSITE DE NOUAKCHOTT FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE
ENZYMOLOGIE Troisième année Biologie et STA1

Elaboré par : Ali O. Med Salem O. BOUKHARY

2009-2010
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SOMMAIRE

Etude de l’activité de la b-fructofuranosidase (invertase) de la levure
TP 1. Extraction de l’invertase de la levure et étalonnage d’une solution standardde glucose + fructose pour la méthode a l’acide dinitrosalicylique (DNS) TP 2. Détermination de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique TP 3. Détermination des constantes cinétiques KM et Vmax d’une réaction enzymatique TP 4. Etude de l’influence du pH et de la température sur une réaction enzymatique

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Extraction et étude de l’activité de la b-fructofuranosidase (invertase) de lalevure
GENERALITES Le saccharose est le plus répandu des diholosides, Il est extrait de la betterave et de la 20 canne à sucre. C'est un sucre non réducteur dextrogyre ( [a ]D = +66,5° ) qui par hydrolyse chimique ou enzymatique, libère un mélange équimolaire de glucose et de fructose, tous deux 20 réducteurs. Leur pouvoir rotatoire global est lévogyre ( [a ]D = -20°) ). On donne ainsi à cemélange le nom de sucre Inverti. (Inversion du pouvoir rotatoire). L'inverstase ou ß-fructofuranosidase est une hydrolase capable de scinder le saccharose en glucose et fructose par rupture des liaisons ß-fructofuranosiques. α-D-glucopyranosyl (1®2) ß-D-fructofuranoside (Saccharose) H2O Invertase

α-D-glucopyranose + ß-D-fructofuranose (Glucose) (Fructose) L'activité enzymatique de l’invertasepeut être étudiée en dosant les sucres réducteurs libérés après hydrolyse par une des méthodes suivantes : - En mesurant la variation du pouvoir rotatoire en fonction du temps d'hydrolyse - La méthode au ferrocyanure de potassium - La méthode à la glucose-oxydase - Par réduction à la liqueur de Fehling - La méthode à l’acide 3,5-dinitrosalicylique ou DNS (c'est cette dernière que nous utiliserons)Pour une enzyme on définit d'une part : - L'unité A comme la quantité d'enzyme qui libère l mg d'hexose réducteur (glucose plus fructose) en 3 minutes. - L'activité enzymatique comme le nombre de micromoles de saccharose hydrolysé par mn. L'activité spécifique comme le nombre de micromoles de saccharose hydrolysé par mn et par mg de protéines solubles.

BUT : Il s'agit d'extraire la fractionsoluble de la levure de boulangerie, de mettre en évidence l'activité invertase dans l'extrait cellulaire et de déterminer les conditions optimales de cette activité enzymatique. Ces expériences illustrent le mode d'action des enzymes en général.

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TP 1. EXTRACTION DE L’INVERTASE ET ETALONNAGE D’UNE SOLUTION STANDARD DE GLUCOSE ET FRUCTOSE POUR LA METHODE A L’ACIDE 3,5 DINITROSALICYLIQUE(DNS)

A. EXTRACTION DE LA FRACTION SOLUBLE DE LA LEVURE DE BOULANGERIE
L’invertase est une enzyme intracellulaire, son extraction nécessite obligatoirement la rupture de la membrane cellulaire. 1 - Matériel et réactifs - levure de boulangerie (Saccharomyces cerevisiae) - pipettes - éprouvettes - centrifugeuse - tubes à centrifuger (2/binôme) - flacons pour la congélation - bicarbonate desodium à 0,1M (préparation : 8,4 g dans 1L eau distillée) 2 - Mode opératoire - Suspendre 10g de levure de boulangerie dans 40 ml de bicarbonate de sodium à 0,1M - Incuber à 35-40°C pendant 24H - Centrifuger à 5000 tr/min pendant 5 min - Après centrifugation, récupérer le surnageant contenant les molécules solubles entre autres l’invertase. - Jeter le culot formé de débris cellulaire - Noter levolume total de surnageant (éprouvette). - Conserver le surnageant au froid pour les manipulations ultérieures. B. GAMME D'ETALONNAGE POUR LA METHODE COLORIMETRIQUE A L’ACIDE DINITROSALICYLIQUE En milieu alcalin et à chaud, l’acide 3,5-dinitrosalicylique (3,5-DNS) jaune est réduit par les oses réducteurs en acide 3-amino 5-nitrosalicylique rouge orangé.

Sucre réducteur

Sucre oxydé

Acide...
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