TP : étude expérimentale de la phosphatase alcaline

But
Nous cherchons à déterminer les paramètres cinétiques d’une enzyme, la phosphatase alcaline, en présence d’un ou de deux substrats. Pour cela nous avons, dans un premier temps, étudié l’activité de cette enzyme en présence de différentes concentrations d’un seul substrat. Ce qui nous a ensuite permis de l’étudier en présence de deux substrats.

Principe
Le p-nitrophényl phosphate (PNPP), qui sera notre premier substrat, est un composé incolore qui peut être hydrolysé pour libérer du p-nitrophénol (PNP). Ce produit est de couleur jaune et peut être dosé par spectrophotométrie à 410nm.

Dans une première partie, nous avons réalisé des mesures en continues d’absorbance par spectrophotométrie. Cela nous a permis de déterminer les paramètres cinétiques propres à la phospahatase alcaline en présence de PNPP.

Dans une seconde partie, nous avons réalisé des mesures en points finales d’absorbance par spectrophotométrie.
Pour cela, nous avons déterminé le temps pour lequel la réaction se trouve toujours en vitesse initiale. Durant la première expérience, la réaction était en vitesse initiale durant environ 30 secondes. Or nous ajoutons cette fois un second substrat, le glycérophosphate, qui peut être hydrolysé par la phosphatase alcaline, tout comme le PNPP. Il s’agit donc d’un inhibiteur compétitif du PNPP ce qui ralenti la vitesse de réaction. Ainsi nous avons estimé qu’à 3 minutes la réaction était encore en vitesse initiale. De plus, ce temps est assez long pour que nos valeurs d’absorbances soient exploitables.

Nous avons pu exploiter nos résultats de spectrophotométrie grâce à nos deux gammes étalons et à la loi de Beer-Lambert : avec : A = absorbance
= coefficient d’extinction molaire (L.mol-1.cm-1) l = longueur de la cuve (1 cm)
C = concentration de la solution (mol.L-1)

Résultats

Etude cinétique de la libération des produits de la réaction :

Gamme étalon :

Pour la