Tp enzymologie

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TP : étude expérimentale de la phosphatase alcaline

But
Nous cherchons à déterminer les paramètres cinétiques d’une enzyme, la phosphatase alcaline, en présence d’un ou de deux substrats. Pour cela nous avons, dans un premier temps, étudié l’activité de cette enzyme en présence de différentes concentrations d’un seul substrat. Ce qui nous a ensuite permis de l’étudier en présence de deuxsubstrats.

Principe
Le p-nitrophényl phosphate (PNPP), qui sera notre premier substrat, est un composé incolore qui peut être hydrolysé pour libérer du p-nitrophénol (PNP). Ce produit est de couleur jaune et peut être dosé par spectrophotométrie à 410nm.

Dans une première partie, nous avons réalisé des mesures en continues d’absorbance par spectrophotométrie. Cela nous a permis de déterminerles paramètres cinétiques propres à la phospahatase alcaline en présence de PNPP.

Dans une seconde partie, nous avons réalisé des mesures en points finales d’absorbance par spectrophotométrie.
Pour cela, nous avons déterminé le temps pour lequel la réaction se trouve toujours en vitesse initiale. Durant la première expérience, la réaction était en vitesse initiale durant environ 30 secondes.Or nous ajoutons cette fois un second substrat, le glycérophosphate, qui peut être hydrolysé par la phosphatase alcaline, tout comme le PNPP. Il s’agit donc d’un inhibiteur compétitif du PNPP ce qui ralenti la vitesse de réaction. Ainsi nous avons estimé qu’à 3 minutes la réaction était encore en vitesse initiale. De plus, ce temps est assez long pour que nos valeurs d’absorbances soientexploitables.

Nous avons pu exploiter nos résultats de spectrophotométrie grâce à nos deux gammes étalons et à la loi de Beer-Lambert : avec : A = absorbance
= coefficient d’extinction molaire (L.mol-1.cm-1)
l = longueur de la cuve (1 cm)
C = concentration de la solution (mol.L-1)

Résultats

Etude cinétique de la libération des produits de la réaction :

Gamme étalon :

Pour laréaliser, nous avons ajouté du PNP de concentration croissante. Grâce à cette droite étalon nous pourrons, par la suite, établir une correspondance entre la densité optique que l’on obtiendra pour différents essais enzymatiques et la concentration de PNP dans ceux-ci.

| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
Tampon tris-HCl 0.1 M pH 8.3 0.75mL | + | + | + | +| + | + |
PNP 0.5 M (mL) | 0 | 0.025 | 0.050 | 0.100 | 0.150 | 0.200 |
ZnCl2 0.6 mM 0.25 mL | + | + | + | + | + | + |
H2O (mL) | 1.000 | 0.975 | 0.950 | 0.900 | 0.850 | 0.800 |

Préparation des solutions de substrats :

Nous avons réalisé une dilution en cascade à partir d’une solution dePNPP de concentration 5mM.

Il y a conservation de masse lors d’une dilution, nous aurons donc :
Cmère Vmère = Cfille Vfille

Soit , ce qui nous permet de déterminer les différents volumes à prélever pour les différentes dilutions.

Exemple pour la solution à 2,5mM :

Concentration de la solution S | Volume de la solution S-1 à prélever | Volume d’eau à rajouter | Volumetotal de la solution S | Volume prélevé pour la solution S+1 | Volume final de la solution S après prélèvement |
2.5mM | 15mL | 15mL | 30mL | 12mL | 18mL |
1mM | 12mL | 18mL | 30mL | 15mL | 15mL |
0.5mM | 15mL | 15mL | 30mL | 15mL | 15mL |
0.25mM | 145mL | 15mL | 30mL | 17,5mL | 12,5mL|
0.175mM | 17,5mL | 7,5mL | 25mL | 10mL | 15mL |
0.125mM | 10mL | 4mL | 14mL | 0mL | 14mL |

Résultats :

Gamme étalon : (voir annexe 1)

Tubes | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
Concentration de PNP (en mM) | 0 | 6,25.10-3 | 12,5.10-3 | 25.10-3 | 37,5.10-3 | 50.10-3 |...
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