Tp lactate deshydrogénase

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  • Publié le : 24 mars 2011
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Lactate déshydrogénase : purification partielle par chromatographie d'affinité

La lactate déshydrogénase (LDH) est une enzyme présente dans une grande diversité d'organismes, aussi bien végétaux qu'animaux. Elle catalyse la conversion réciproque de la pyruvate et de la lactate accompagnée de la conversion concomitante du NADH en NAD+ (et inversement). Ce tétramère est composé de 4 sous unité(isoenzyme) différents de par leurs constance cinétiques et leurs pH isoélectriques.

Le but de ce TP est de purifier la LDH (ici de façon partielle) au moyen d'une chromatographie d'affinité en colonne.

Le principe de la chromatographie d'affinité repose sur l'attirance entre l'enzyme et sont substrat. On choisit ici d'isoler l'enzyme sur gel de cibacron analogue du NAD+ (bleu de cibracronfixé par covalence à une phase stationnaire dans une colonne). L'enzyme se fixe alors de manière non covalente au bleu, laissant ainsi les impureté (autres protéines) passer entre les maille du gel de cibracron et être éluées en dehors de la colonne, la purification ne sera partielle car le bleu de cibracron est relativement peu spécifique de la LDH, en effet il est spécifique à un groupe deprotéine. On récupère enfin l'enzyme après lavage avec un éluant avec un tampon content du NADH et de l'acide oxamique : un analogue du pyruvate. L'acide oxamique créera avec l'enzyme une liaison covalente cette fois beaucoup plus forte que celle créée entre l'enzyme et le bleu de cibacron, permettant ainsi d'arracher du gel au moyen d'une élution par compétition, on obtient alors l'extrait enzymatiqueou essaie.

Afin de contrôler l'activité enzymatique de l'extrait, on réalise une cinétique de celle-ci par spectrophotométrie. La LDH catalysant la transformation du lactate en pyruvate (et inversement), on suit l'oxydation du lactate absorbant a 340 nm.
ensuite d'après la loi de Beer-Lambert, on calcule la concentration du lactate en fonction du temps,

A= є . l. C avec a= absorbance (UA)є= coefficient d'extinction molaire (M-1.cm-1)
C=concentration (mol-1)

plus le taux de lactate diminue plus l'activité enzymatique augmente représentant ainsi l'activité enzymatique de la LDH dans l'essaie .

Les deux électrophorèses, servent à tester la qualité de la purification. L'une a été réalisée en milieu dénaturant, l'enzyme perd ainsi sa configuration spatiale et migre sur le gelen fonction de son poids, L'autre a été réalisé en milieu non dénaturant, l'enzyme migre en fonction de sa charge.

Enfin cherchant à connaître l'activité enzymatique de la LDH, nous réalisons un dosage calorimétrique selon la méthode de Bradford qui se base sur la fixation du bleu de Coomassie sur les protéines. Pour cela, il faut réaliser une gamme étalon faisant varier la quantité ( et doncl'intensité) du bleu de Coomassie. Par lecture spectrophotométrique de la gamme et comparaison des deux, nous déterminons l'activité enzymatique de l'enzyme.

De part ce TP, nous pourrons analyser une technique de purification de manière qualitative et quantitative, en estimant son rendement et son facteur de purification

L’équilibration a pour but d’éliminer les éventuels résidus présentsdans la colonne afin que la colonne présente les mêmes conditions physico-chimiques que l’extrait à déposer.

La LDH et les autres déshydrogénases vont se fixer au bleu de Cibacron par liaison covalente. De ce fait, elles sont retenues sur le gel.

Cette étape permet d’éliminer les petites protéines non retenues par le bleu de Cibacron dans le gel.

Ces 3 étapes sont nécessaires afin dedécrocher les protéines ayant interagit avec le ligand.

Résultats :

Dosage des protéines :

On trace la droite d'absorbance de la gamme étalon (voir ci joint) pour obtenir un coefficient directeur de 0,05DO/microgrammes.
(0,3-0,1)/(6-2)

On applique cette valeurs a l'absorbance corrigée ( valeur d'absorbance obtenu après avoir soustrait la valeur du blanc a 0 microgrammes) obtenue pour...