La Phosphatase alcaline

Le but du TP Nous voulons étudier la Phosphatase alcaline. Nous voulons observer ce que devient son activité lorsque l’on fait varier différents facteurs, comme la concentration en substrat initiale dans une première partie, et le pH dans une seconde. Pour s'intéresser à son activité, on se servira du calcul de son activité spécifique dans une situation donnée, et de certaines représentations de la vitesse de réaction en fonction de la concentration en substrat, ou en fonction du pH. Principe La Phosphatase alcaline est une enzyme, c’est donc une molécule qui abaisse l’énergie d’activation d’une réaction, ici celle de la réaction d’hydrolyse de la liaison monoester du PNPP. Ce substrat est incolore, et son hydrolyse produit du PNP jaune absorbant à 410 nm. Quand on mettra le substrat en présence de l’enzyme, il sera alors possible de mesurer l’absorbance à 410nm de la solution en fonction du temps, reflétant l’apparition de PNP, et ainsi en déduire des vitesses de réaction. C’est ce que nous ferons pour chaque facteur étudié: pour la concentration en PNPP initiale, et le pH. La gamme étalon Le zéro fait avec de l’eau distillée, on mesure ensuite l’absorbance de chacun des six tubes contenant des volumes croissants de PNP à 0,5 mM (six tubes: 0; 0,025; 0,05; 0,1; 0,15 et 0,2 mL). Le changement d’absorbance est directement proportionnel à a quantité de PNP dans la cuve. On y ajoute aussi du tampon Tris-HCL pH 8,3 servant à maintenir l’enzyme à un pH optimal pour son fonctionnement, du ZnCl2 0,6 mM, l’ion Zn2+ étant un co-facteur important aussi pour le bon fonctionnement de l’enzyme, et de l’eau. Préparation des solutions de substrat On a effectué une dilution en cascade de PNPP à partir d’une solution mère de 5mM afin de préparer 7 solutions de substrat de 10mL chacune à respectivement 5mM, 2,5mM, 1mM, 0,5mM, 0,25mM, 0,167mM, et 0,125mM.
1 /7

dilution 7,1cm

On utilise la formule C1·V1 = C2·V2 pour calculer les volumes de cette