Tp phosphatase alcaline

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  • Publié le: 11 décembre 2011
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La Phosphatase alcaline

Le but du TP Nous voulons étudier la Phosphatase alcaline. Nous voulons observer ce que devient son activité lorsque l’on fait varier différents facteurs, comme la concentration en substrat initiale dans une première partie, et le pH dans une seconde. Pour s'intéresser à son activité, on se servira du calcul de son activité spécifique dans une situation donnée, et decertaines représentations de la vitesse de réaction en fonction de la concentration en substrat, ou en fonction du pH. Principe La Phosphatase alcaline est une enzyme, c’est donc une molécule qui abaisse l’énergie d’activation d’une réaction, ici celle de la réaction d’hydrolyse de la liaison monoester du PNPP. Ce substrat est incolore, et son hydrolyse produit du PNP jaune absorbant à 410 nm. Quandon mettra le substrat en présence de l’enzyme, il sera alors possible de mesurer l’absorbance à 410nm de la solution en fonction du temps, reflétant l’apparition de PNP, et ainsi en déduire des vitesses de réaction. C’est ce que nous ferons pour chaque facteur étudié: pour la concentration en PNPP initiale, et le pH. La gamme étalon Le zéro fait avec de l’eau distillée, on mesure ensuitel’absorbance de chacun des six tubes contenant des volumes croissants de PNP à 0,5 mM (six tubes: 0; 0,025; 0,05; 0,1; 0,15 et 0,2 mL). Le changement d’absorbance est directement proportionnel à a quantité de PNP dans la cuve. On y ajoute aussi du tampon Tris-HCL pH 8,3 servant à maintenir l’enzyme à un pH optimal pour son fonctionnement, du ZnCl2 0,6 mM, l’ion Zn2+ étant un co-facteur important aussi pour lebon fonctionnement de l’enzyme, et de l’eau. Préparation des solutions de substrat On a effectué une dilution en cascade de PNPP à partir d’une solution mère de 5mM afin de préparer 7 solutions de substrat de 10mL chacune à respectivement 5mM, 2,5mM, 1mM, 0,5mM, 0,25mM, 0,167mM, et 0,125mM.
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dilution 7,1cm

On utilise la formule C1·V1 = C2·V2 pour calculer les volumes de cette dilution.Pour prendre un exemple de calcul: C0,167·V0,167 = C0,125·V0,125 C0,167 = 0,167 mM C0,125 = 0,125 mM V0,125 doit être égal à 10mL Ainsi V0,167 = C0,125·V0,125 ÷ C0,167
= 0,125 × 10 ÷ 0,167
= 7,48 mL, qui est le volume à prélever du tube à 0,167 mM, le volume final de ce tube devant être égal à 10mL, si l’on en prélève 7,48 mL pour le tube suivant à 0,125 mM il faut que son volume total soitde 17,48 mL. On procède exactement de la même manière pour toutes les autres dilutions en amont. Étude cinétique de la libération des produits de la réaction On prépare 7 tubes de solution de substrat avec 1,5 mL de tampon Tris-HCl servant à maintenir un pH idéal pour l’enzyme, 0,5 mL de ZnCl2, l’ion Zn2+ étant un co-facteur important pour le bon fonctionnement de l’enzyme, et 1 mL d’eau. On yrajoute aussi 0,5mL de chaque dilution que nous avons préparées juste avant. On ajoute ensuite 0,25mL d’enzyme au 1,75 mL de solution de substrat présent dans chaque cuve de D.O et on mesure l’absorbance en fonction du temps. On pourra en déduire la quantité de produit formé au cours de la réaction enzymatique, la vitesse initiale de cette réaction en fonction de la concentration en substrat etl’ordre de réaction. Les résultats des mesures sont reportés sur le graphique 1 (figure 2) en annexe. La densité optique mesurée à 410nm de chaque solution nous permet de déterminer la vitesse initiale de chaque réaction, en D.O·min-1, qui correspond à la pente de la partie linéaire de la courbe (slope). Dans notre compte rendu nous ne prendrons en compte que les résultats obtenus pour les tubes A, B, Cet, G même si nous avons fait les calculs pour tous les tubes dans le tableau 2, car les valeurs d’absorbance des autres tubes (D, E et F) ne sont pas dans la continuité croissante de l’absorbance en fonction de la concentration en substrat, sans doute à cause de plusieurs facteurs (dilution, pipettages...).
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Calculs et interprétation La gamme étalon On connait le volume de PNP ainsi...
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