Tp phosphate alcaline

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TP ENZYMOLOGIE
ETUDE CINETIQUE DE LA PHOSPHATASE ALCALINE ET DETERMINATION DU PH OPTIMUM

Introduction
Les phosphatases sont des enzymes qui hydrolysent les monoesters phosphoriques.
Ici, on étudiera les effets de l’enzyme sur le PNPP. La phosphatase alcaline hydrolyse le PNPP suivant la réaction suivante :

PNPP + H2O PNP

Cette réaction libère du PNP. Le PNPP est incolore, alors quele PNP est jaune en milieu alcalin, ce qui permet de le doser directement par spectrophotométrie à 410nm.
Au cours de ce TP, nous allons essayer de déterminer la cinétique de la réaction catalysée par l’enzyme ainsi que son pH optimum. Le ph optimum étant le pH auquel l’enzyme est la plus active.

Explication de la dilution :
Nous avions à disposition 25ml d’une solution de PNPP à 5mM. Nousavons fait une dilution en cascade de manière à ne pas jeter de solution à la fin.
* Pour la première dilution, nous voulons une dilution.
Nous avons prélevés 10mL de la solution de PNPP auquel nous avons rajouté 10mL d’eau. Nous avons obtenu ainsi 20mL à une concentration de 2,5mM.
* On veut une solution à 1mM. Il faut faire une dilution au .
On prend 20x = 8mL de la solution précédente,auquel on rajoute x 20 = 12mL d’eau. On obtient 20mL d’une solution à 1mM et il reste 10mL de la solution précédente.
* On veut une solution à 0,5mM. Il faut faire une dilution
On prend 10mL de la solution précédente auquel on rajoute 10mL d’eau. On obtient 20mL d’une solution à 0,5mM et il reste 10mL de la solution précédente.
* On veut une solution à 0,25mM. Il faut faire unedilution
On prend 10mL de la solution précédente auquel on ajoute 10mL d’eau.
On obtient 20mL d’une solution à 0,25mM et il reste 10mL de la solution précédente.
* On veut une solution à 0,167mM. Il faut faire une division au.
On prend 10mL de la solution précédente auquel on ajoute 5mL d’eau.
On obtient 15mL d’une solution à 0,167mM et il reste 10mL de la solution précédente.
* On veut unesolution à 0,125mM. Il faut faire une dilution au.
Pour cela on prend 7mL de la solution précédente auquel on rajoute 2,35mL d’eau ( = 9,352. On fait 9,352 -7 = 2,35mL d’eau à ajouter)
On obtient 9,35 d’une solution à 0,125mM et il reste 8mL de la solution précédente.

Réalisation d’une gamme étalon
Pour réaliser cette gamme étalon, nous avons utilisé un tampon Tis-HCl (0.1 M, pH 8.3, 0.75ml) + du ZnCl2 (0.6mM, 0.25mL) + PNP (0.5mM) en quantité variable + H2O en quantité variable pour obtenir 2mL de solution au total.
Pour la lecture des DO, nous avons utilisé un spectrophotomètre.

Résultat et interprétation :
Nous connaissons la concentration du PNP, ainsi que le volume introduit dans chaque tube.
On peut en déduire la concentration de chaque tube:
n = C x V et C =
Tube1: n = 0,5.10-3 x 0 = 0 mol C = = 0 M
Tube 2: n = 0,5.10-3 x 0,025.10-3 = 1,25.10-8 mol C = = 6,25.10-6 M
Tube 3: n = 0,5.10-3 x 0,05.10-3 = 2,5.10-8 mol C = = 1,25.10-5 M
Tube 4: n = 0,5.10-3 x 0,1.10-3 = 5.10-8 mol C = =2,5.10-5 M
Tube 5: n = 0,5.10-3 x 0,15.10-3 = 7,5.10-8 mol C = =3,75.10-5 M
Tube 6: n = 0,5.10-3 x 0,2.10-3= 1.10-7 mol C = =5.10-5 M

DO corrigée = DO lue – DO tube 1:
Tube 1: DO lue = 0 DO corrigée = 0
Tube 2: DO corrigée = 0, 097
Tube 3: DO corrigée = 0,204
Tube 4: DO corrigée = 0,426
Tube 5: DO corrigée = 0,634
Tube 6: DO corrigée = 0,824

A partir de ces mesures, nous pouvons tracer une courbe étalon.

Etude cinétique de la libération des produits de la réaction.∆DO/min équivaut à la pente qui suit une marche linéaire.
La courbe a été obtenue grâce à des densités optiques à 410 nm pendant une durée de 3min.

Pour le tube A:
Concentration en PNPP:
Vtotal = 1,5 ml tampon tris-HCl + 0,5 ml ZNCL2 + 1 ml eau distillée + 0,5 ml de PNPP à 0,125 mM
= 3,5 ml

nPNPP = 0,125.10-3 x 0,5. 10-3 = 6,25.10-8 mol
CPNPP tube A =
CPNPP tube A = =...
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