TP 2 de physiologie vegetale : etude de la reaction de Hill a l’aide de chloroplastes isolees
Présentation générale du TP :
Lors de cette experience nous avions pour objectif principal d’etudier par suivi la reaction de Hill. C’est une reaction d’oxydo-reduction qui ne se deroule que dans le stroma des chloroplastes. Nous utiliserons la technique de mesure de la reduction par spectrophotometrie, comparer le rendement de la reaction dans differentes conditions. Nous utiliserons le DCPIP (bleu) comme reactif de Hill dont la reduction depend des differentes conditions testees et qui le decolore. Nous nous interesserons aux cas suivant : -A la lumiere (2 echantillons avec et un sans disulfite de sodium. En effet le disulfite de sodium qui decolore en quasi totalite le DCPIP et nous servira donc de zero pour les mesures). -A l’obscurite (pour mesurer la reaction du reduction provoquee par d’eventuels acides naturels presents dans les chloroplastes). -Tube chauffee (chloroplastes denatures)
Preparation :
Afin d’isoler les chloroplastes d’epinards, nous en avons decoupe les feuilles en petits morceaux avant de les broyer au mortier. Le broyat est melange a une solution tampon phosphate-saccharose (pH 6.5) avant d’etre filtree.
Nous cherchons a preparer la solution du dosage spectrophotometrique. On prepare donc une solution d’acetone a 80% en y ajoutant du filtart et de l’eau distillee.
On agite fortement ensuite la solution pour s’assurer de liberer les chlorophylles de la paroi des chloroplastes. On la centrifuge ensuite pour obtenir une solution « pure » en chloroplaste. On recupere donc le surnageant en laissant le depot qui aurait pu influencer nos resultats.
Afin de preparer les conditions d’experimentation voulues il est necessaire de connaitre la concentration en chlorophylles de chaque tube a essai. Cette concentration massique est obtenue grace a la formule suivante : Calcul de concentration de la solution mere (solution d’acetone a 80%) :