Tp salicyalte

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  • Publié le : 19 avril 2011
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Etude in vitro de l’hépatotoxicité du paracétamol et de l’aspirine sur les lignées HepG2 et HepaRG

But de l’expérience :
On cherche à évaluer la toxicité du paracétamol et de l’aspirine sur deux lignées hépatocytaires isolées à partir de tumeurs :
- HepG2, qui n’exprime que 2 CYP (1A1 et 3A7)
- HepaRG qui exprime la majorité des CYPs impliqués dans lemétabolisme des médicaments

Principe :
- Paracétamol : Le paracétamol est métabolisé exclusivement et entièrement par le foie. Il forme un composé très réactif le N-acétyl-p-benzoquinonimine ou NAPQI. En cas de surdosage, le NAPQI ne pourra plus être conjugué au glutathion, et provoquera une nécrose centrolobulaire par formation d’adduits.

- Salicylate :
50% de l’aspirine est métabolisé par lefoie. Le mécanisme de toxicité du salicylate n’est pas totalement compris, mais est lié à une atteinte mitochondriale conduisant à l’apoptose ou la nécrose.

Première manipulation :
Les cellules des lignées HepG2 et HepaRG sont incubées 24H en présence de concentrations croissantes de la molécule étudiée, en trois exemplaires.

- Paracétamol : A partir de la solution à 1M, on prépare unesolution de 10mL à 10mM dans un milieu SVF/DMSO en prélevant 100µL de la solution mère. Le DMSO est indispensable car le paracétamol n’est pas soluble dans le milieu.
Le puits témoin ne contient que du milieu et 100µL de DMSO. Dans le premier puits, on dépose 100µL de la solution à 10mM. Dans le second puits, on dépose 100µL de cette même solution + 100µL de milieu, afin d’obtenir une concentration de5mM. Grace à une série de dilutions au demi, on obtient au final 9 puits avec des concentrations en paracétamol allant de 0,04 à 10mM et un puits témoin n’en contenant pas, et ceci en 3 exemplaires pour chaque lignée étudiée.

- Salicylate : De la même manière on met les cellules des deux lignées en contact de milieu de concentration en salicylate allant de 2 à 50mM. La présence de DMSO n’estpas utile car le salicylate est soluble dans le milieu.

Deuxième manipulation : test de viabilité cellulaire au MTT
PRINCIPE :
Le MTT ou bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium est transformé par des déshydrogénases mitochondriales de cellules vivantes en cristaux de formazan pourpres insolubles.
Une heure après ajout de 100µL de la solution de MTT, on dissout lescristaux formés par le DMSO.
On mesure ensuite l’absorbance au spectrophotomètre. Les valeurs de DO (densité optique) à 540nm sont proportionnelles à la concentration en cristaux et donc au nombre de cellules vivantes. On aura également mesuré la DO du DMSO seul, afin d’obtenir la DO corrigée, c’est-à-dire la valeur moyenne des 3 DO mesurées à laquelle on soustrait celle du DMSO (0,055 dans ce cas)Résultats :
- Paracétamol : On aura également mesuré la DO du DMSO seul, afin d’obtenir la DO corrigée, c’est-à-dire la valeur moyenne des 3 DO mesurées à laquelle on soustrait celle du DMSO (0,055 dans ce cas). On obtient alors ces valeurs pour la lignée HepG2 :
|Concentration |DO corrigée |
|(mM) | |
|10|4.354 |
|5 |4,143 |
|2,5 |3.957 |
|1,25 |3.466 |
|0,625 |3.367 |
|0,3125 |2.581 |
|0,16 |3.335 |
|0,08 |3.432 |
|0,04|2.669 |
|0 (témoin) |4.370 |

Ce qui nous permet de tracer la courbe suivante :
Mesure de la DO en fonction de la concentration en paracétamol du milieu :

[pic]

Ces résultats ne permettent pas de déterminer la CI50, concentration en paracétamol pour laquelle on aurait une diminution de la DO de 50 % par rapport au témoin.
Cependant...
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