Tp specificite des actions enzymatiques: les glycosidases

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  • Publié le : 4 décembre 2011
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TP SPECIFICITE DES ACTIONS ENZYMATIQUES: LES GLYCOSIDASES |

I – BUT

Le but de ce TP est de déterminer la structure d’un diholoside par l’action enzymatique spécifique des glycosidases et de mettre en évidence son pouvoir réducteur éventuel par le test à la liqueur de Fehling.

II – Principes

Action des glycosidases :

Les glycosidases font partie de la famille des hydrolasesc'est-à-dire qu’elles catalysent la rupture de liaisons osidiques afin de libérer un ou plusieurs composés osidiques. Ces hydrolases ont la particularité d’être très spécifiques, en effet leur particularité d’action dépend (principalement):
De la nature du résidu glucidique impliqué dans la liaison
De la configuration D ou L de l’ose
De la configuration anomérique (α ou β)
Le typede liaison reliant les osyl
De sa forme cyclique (pyranose ou furanose)
Il est donc possible d’identifier les sucres présents dans un polyoside en le faisant réagir avec toute une gamme d’enzymes connues. En effet si un polyoside réagit avec une enzyme spécifique à un sucre, une forme cyclique et une liaison, on peut déduire que le sucre correspondant à l’enzyme, sous la forme cycliquespécifique à cette enzyme est présent dans le polyoside et qu’il est relié aux autres sucres par le type de liaisons spécifique à l’enzyme. Car si un seul des critères de spécificité n’est pas respecté l’hydrolyse n’est pas catalysée par l’enzyme.

Mise en évidence du pouvoir réducteur à la liqueur de Fehling

Elle permet de mettre en évidence la présence de sucre réducteur en solutionc'est-à-dire possédant un OH anomérique non engagé dans une liaison osidique. Initialement bleu (Cu2+), la liqueur de Fehling forme un précipité rouge brique (Cu2O) à chaud en présence de sucre réducteur. En effet, l’ion cuivre II oxyde l’aldéhyde pour donner un précipité de couleur rouge brique : oxyde de cuivre I Cu2O, selon la réaction suivante:
R-CHO + 2 Cu2+(aq) + HO -( aq) RCOO - + Cu2O(s) + H2ODans le cas des sucres, il y a pouvoir réducteur seulement si le OH anomérique est libre. Donc si une solution de sucre devient rouge en présence de liqueur de Fehling c’est que le OH anomérique du sucre en solution n’a pas été substitué ou engagé dans une liaison.

CCM

La technique de la chromatographie sur couche mince  se base sur la différence de solubilité des composés induite par desjeux de polarité entre les molécules. Dans notre cas, la phase mobile est un solvant très polaire, l'acétone qui migre par capillarité dans la phase stationnaire: une plaque de silice qui est un composé polaire (mais moins polaire que la phase mobile). L'affinité avec la phase stationnaire diminue donc avec la polarité et le solvant étant plus polaire, la distance de migration augmente lorsque lapolarité augmente.
En comparant les rapports frontaux des différents tubes avec ceux des témoins, le principe est le suivant: si les rapports frontaux sont significativement identiques, on déduit qu'il s'agit de la même molécule.
Les rapport frontaux : Rf=h/H correspondent à la distance de migrations des molécules divisé par la distance de migration du front du solvant. Ce rapport frontalest donc caractéristique d'une espèce chimique.

III – Résultats et interprétations :

Chromatographie :
Légendes du chromatogramme:
Dépôt 1 – D-Glc
Dépôt 2 – D-Gal
Dépôt 3 – D-Fru
Dépôt 4 – Tube 1 : Diholoside + Tampon pH 4,8 (témoin négatif)
Dépôt 5 – Tube 2 : Diholoside + Tampon pH 4,8 + bêta-D-Fructosidase
Dépôt 6 – Tube 3 : Diholoside + Tampon pH 4,8 + bêta-D-Glucosidase
Dépôt7 – Tube 4 : Diholoside + Tampon pH 6,4 + alpha-D-Glucosidase
Dépôt 8- Tube 5 : Diholoside + tampon pH 7,2 + bêta-D-Galactosidase
Dépôt 9 – Mélange D-Glc + D-Gal + D-Fru

Dépôt | glucose | galactose | fructose | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | mélange |
Distance de migration (cm) | 2,0 | 1,3 | 3,6 | 0,7 | 0,7 | 0,7 | 0,7 1,9 |...
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