Biochimie | TD : Détermination des paramètres cinétiques Vmax (activité catalytique) et KM (constante de Michaelis) de la -galactosidase |

a) Données Boehringer :-D-galactoside galactohydrolase EC 3.2.1.23, isolée d’Escherichia coli. La -galactosidase hydrolyse les résidus -galactopryranosyl de diosides comme le lactose (Gal14Glc) et le lactulose (Gal14Fru) ; d’hétérosides comme l’ONPG (2-nitrophényl -galactoside). La -galactosidase d’Escherichia coli, dont la masse molaire est de 540 000 g.mol-1, est une protéine constituée de quatre chaînes identiques. | hydrolyse du lactose par la -galactosidase : hydrolyse de l’ONPG par la -galactosidase : |

b) Données Boehringer : KM et taux relatifs d’hydrolyse (tampon phosphate de potassium, Mg2+, 2-mercapto-éthanol, pH = 7,6, T = 30°C) : | KM | Taux relatif d’hydrolyse | 2-nitrophényl-galactoside (ONPG) | 0,95 mmol.dm-3 | 1,00 | 4-nitrophényl-galactoside | 0,45 mmol.dm-3 | 0,14 | phenyl -galactoside | 3,2 mmol.dm-3 | 0,05 | lactose | 7,5 mmol.dm-3 | 0,07 |

La détermination des paramètres cinétiques Vmax et KM de la -galactosidase est entreprise. La détermination de la vitesse initiale est réalisée selon la méthode en 2 points.

1. Étude des conditions expérimentales de la méthode en 2 points

1.1. Détermination du coefficient d'absorbance linéique molaire M de l'ONP
Le coefficient M à utiliser pour calculer la vitesse initiale en UI à partir de la vitesse initiale "brute" (en A/t) doit correspondre aux conditions de lecture de l'absorbance, après addition du réactif d'arrêt. En particulier, l'ONP possède une fonction phénol acido-basique et l'M dépend du pourcentage de forme déprotonée et donc du pH ; il est plus élevé en milieu alcalin. Une gamme d'étalonnage est donc réalisée en respectant les conditions acido-basiques de la lecture de la réaction enzymatique.

Réactifs :
• Solution d'ONP à 1 mmol.L-1
• Solution tampon phosphate de potassium, Mg2+,