Le 3 juillet 1854 à Hukvaldy, Amálie Janáček donne le jour à Leoš, neuvième enfant d'une famille qui en vit naître treize. Son père Jiří, instituteur du village, l'envoie à onze ans dans un monastère de Brno, où il étudie la musique sous la direction de Pavel Křížkovský. Il est remarqué grâce à ses prestations dans le chœur du monastère. Ses études le mènent alors pour deux ans à l'école d'orgue Skuherský à Prague, puis aux conservatoires de Leipzig, où il reçoit notamment l'enseignement de Carl Reinecke, et de Vienne. Il rencontre en 1874 Antonín Dvořák à Prague. C'est le début d'une longue amitié. Antonín Dvořák critiquera à titre amical ses premières compositions et influencera durablement Leoš Janáček par sa manière de composer en épousant les intonations de la langue parlée.

En 1881, année de son mariage avec Zdenka Schulzová, il retourne à Brno pour se consacrer à l'éducation de la musique. Il y fonde une école d'orgue qu'il dirigea jusqu'en 1920 ; cette école va d'ailleurs devenir plus tard le Conservatoire de Brno. Il aura deux enfants : le premier meurt en bas âge en 1890, la seconde, Olga, à l'âge de 17 ans. La mort de cette dernière est contemporaine de l'achèvement de son opéra Jenůfa et lui inspire ses plus belles pages, marquant ainsi une rupture stylistique ; ce qui permet de ranger le compositeur aux côtés des découvreurs de la musique du xxe siècle tels Kodaly, Bartók, Szymanowski ou Enesco, ses frères de l'Est, et même Stravinsky, bien loin des romantiques ou post-romantiques comme son ami Dvořák. Sa réputation reste jusque là cantonnée à sa province, mais la création en 1916 d'une version remaniée de son opéra Jenůfa lui ouvre les portes de la capitale et une certaine reconnaissance. Il tombe alors amoureux d'une femme mariée, Kamila Stösslová, amour platonique car Kamila, qui a 38 ans de moins que le compositeur, est totalement indifférente. Déçu et obsédé par sa passion, il fera un portrait à charge de Kamila dans L'Affaire