CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION SUR GEL DE SEPHADEX

INTRODUCTION :

On se propose au cours de ce TP de séparer un mélange de deux macromolécules protéiques de masses moléculaires différentes (SAB et cytochrome c ) par méthode de chromatographie d'exclusion sur gel séphadex (G50) en déterminant les caractéristiques de notre colonne par exclusion grâce au dextran bleu , de vérifier ensuite notre séparation par spectrométrie et de doser par méthode de Lowry et al nos fraction obtenue .

PRINCIPE ET BUT :

La chromatographie d’exclusion moléculaire (aussi appelée tamis moléculaire ou filtration sur gel) permet de séparer les protéines suivant leur rayon de Stockes. En effet, le volume d’élution(Ve) d’une protéine donnée dépend non seulement de sa masse moléculaire mais également de sa forme, de son hydratation préférentielle, de sa densité, voire de son affinité pour le support. Le rayon de Stockes tient compte de tous ces paramètres .

Notre gel utilisé pour ce TP est le Sephadex G-50 dont le domaine de fractionnement est 1500-30000 pour les masses moléculaire globulaire , le sephadex étant des chaînes de polysaccharides (dextran) ramifiées dont les pores sont déterminés par le degré de « cross-linkage » c'est à dire la fréquence des ponts reliant les chaînes.

L'une de nos protéines à séparer est la SAB (sérumalbumine bovine) de masse moléculaire 66000 DALTON supérieur au domaine de fractionnement qui est compris entre 1500- 30000 DALTON ,exclue du gel elle sera donc éluée en premier.

La seconde protéine à séparer est le cytochrome c de masse moléculaire 12400 dalton est compris dans le domaine de fractionnement, il peut pénétrer plus ou moins profondément dans les pores et ce sera donc la seconde fraction éluée .

Étant donné que les protéines ont un maximum d'absorbance à 280 nm dû aux aminoacides aromatiques et que le cytochrome c de couleur rouge est visible à 409 nm , on peut déterminer par spectrophotométrie la concentration de