Clonage

Pages: 20 (4893 mots) Publié le: 28 mars 2013
MONTGAILLARD Gilles


FREJEBISE Cédric
























JANVIER 2000 IUP BIOINGENIERIE
OPTION 1 2ème ANNEE




Introduction

A. Construction du vecteur pUT 807


I. Présentation des plasmides

1. Plasmide pUT 599
2. Plasmide pUT 654
3. PlasmidepUT 807
4. Intérêt du plasmide pUT 807
II. Principe des méthodes utilisées.
1. La PCR
2. Intérêt de la PCR et conditions opératoires
3. Réactions enzymatiques : restriction et ligation
4. Electrophorèse en gel d’agarose
a) Migration/Séparation
b) Conditions opératoires
c)Visualisation
d) Purification

III. Résultats et discussion

1. Gel 1
2. Gel 2
B. Transformation bactérienne

I. principes
1. la chimiocompétence
2. l’électroperméabilisation
II. Résultats et discussion

C. Technique d’analyse des protéines recombinantes
I. principes


1. Extraction des protéinescellulaires
2. Electrophorèse en SDS-PAGE
3. Transfert sur membrane de nitrocellulose
4. Révélation et immunodétection
II. Résultats et discussion

D. Analyse de l’ADN recombinant
I. Principes
1. Extraction d’ADN plasmidique
1. Digestion des plasmides
2. Séquençage par la méthode de Sanger

II. Résultats etdiscussion

1. Gel 1: ADN plasmidiques non digérés
2. Gel 2: ADN plasmidiques digérés par les enzymes
3. Séquençage
Conclusion





INTRODUCTION







La transformation bactérienne utilisant de l’ADN plasmidique modifié par le soin des expérimentateurs est devenue monnaie courante dans les laboratoires de biologie moléculaire et de génétique. Cecitouche toutes les activités de clonage et les créations de nouvelles souches plus facilement sélectionnables. Mais ces techniques sont aussi largement utilisées dans le monde industriel et pharmaceutique pour l’application majeure de la production de protéines recombinantes ou protéines chimères.
Ce type de travail s’est aussi développé dans le cas des cellules eucaryotes et en particulier decellules humaines pour la transfection de gènes. Les applications cliniques sont nombreuses comme par exemple les insertions de gènes suicides dans le traitement des tumeurs.
Le but de ce TP sera d’insérer un gène d’intérêt thérapeutique dans un plasmide, le gène thymidine kinase du virus de l’hérpes. Pour cela nous utiliserons trois plasmides différents et toute la machinerie de biologiemoléculaire dont nous disposons.
































Construction du vecteur pUT 807




PUT 599 pUT 654



PCR de l'insert Digestion par les enzymes
de restriction



Purification sur gelrécupération des fragments



Digestion par les enzymes vecteur linéaire
de restriction



Ligation et formation du pUT 807



Présentation des plasmides



1. Plasmide pUT 599

Le plasmide de 4268 pb contient l’insert , il correspond au fragment EcoRI/SgrAI. Cet insert comprend :
-Le promoteurEnh-Tkprom qui est un promoteur fort et constitutif des cellules Eucaryotes.
-Le promoteur EM-7 qui est un promoteur synthétique fort des cellules Procaryotes.
-Le gène codant pour la thymidine kinase du virus de l’herpès.
-Une partie du gène de résistance à la zéocine.

2. Plasmide pUT 654


Le plasmide de 6150 pb contient le vecteur . Il se compose :

-La deuxiéme...
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