connaissance du marché et des consomateur

Pages: 24 (5780 mots) Publié le: 22 janvier 2015
TP chimie physique I Page 1
Semestre d’automne 2007
Elliott Croset
Alexandre Dumoulin
(Groupe E)
CINÉTIQUE
I. But de l’expérience
Etude de la cinétique d’une réaction catalysée par la trypsine, une enzyme
digestive du suc pancréatique.
II. Notions théoriques
La catalyse par le biais de la trypsine permet d’abaisser l’énergie d’activation
d’une réaction donnée, en l’occurrence,l’hydrolyse d’une liaison peptidique dans le BAPNA
(N-benzoyl-arginine-p-nitroanilide) qui est soluble dans le DMSO. Cette réaction nous donne
un équivalent carboxylique de la N-benzoyl-arginine et une molécule de p-nitroaniline de
couleur jaune:
N
O
H
NH
NO2
(CH2)3
N
H
H2N NH
O
N
O
H
NH
(CH2)3
H2N NH
O
OH
NO2
NH2
Trypsine
H2O
+
N-benzoyl-arginine-p-nitroanilide
(BAPNA)p-nitroaniline
(jaune)
L’exemple de mécanisme que nous allons étudier ici est le mécanisme de Michaelis-Menten :
• Considérons une réaction enzymatique qui passe par la formation d’un complexe
intermédiaire (ES) :
E S a a ES b E P +←k (k')→k →+
• On admet qu’au début de la réaction, la vitesse de réaction est constante :
V k [ES] 0
= b
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• On peut obtenir l’équation suivante, en considérant les différentes vitesses de
formation, ainsi qu’en considérant la concentration de l’enzyme comme beaucoup plus
faible que celle du substrat :
a b
a total
k' k
k ([E] [ES])[S] [ES]
+

=
Avec [ES] = concentration de complexe intermédiaire = a b
a
k' k
k [E][S] [ES]
+
=
[E]total =concentration totale d’enzyme = [E] + [ES]
• Posons a
a b
M
k
k' k
K
+
=
= constante de Michaelis.
• Si la concentration du substrat est beaucoup plus grande que KM, on
obtient l’équation de Michaelis-Menten :
K [S]
[S] V V
M
0 max +
=
• On peut réarranger l’équation de la manière suivante :
max max
M
0 V
1
[S]
1
V
K
V
1
= ⋅ +
En traçant 1/V0 en fonction de 1/[S], onobtient une droite avec 1/Vmax comme ordonnée à
l’origine et -1/KM lorsque y=0. Cette représentation s’appelle « Linearweaver – Burk plot »
• Nous allons donc déterminer les V0 de réactions avec des concentrations de substrat
différentes, afin de pouvoir tracer le graphique.
III. Partie expérimentale
Nous avons utilisé différentes pipettes (1,2,5 mL), une seringue et des fioles de 5
mL pourprocéder aux conceptions des différentes solutions que l’ont a mis dans une cuve de
1 cm de large dans un spectrophotomètre réglé à 400 nm afin de calculer les différentes
absorptions.
Le principe de mesure est le suivant. Il faut pour chaque concentration du mélange
BAPNA/DMSO effectué une mise à zéro de l’absorbance à 400 nm avec une solution tampon
dans une cuvette. Ensuite on met dans une autrecuvette 2,5 mL (avec une pipette) de la
solution d’enzyme, on y ajoute 0,5 mL d’une des solutions préalablement préparées (avec une
seringue) on met un filme de parafilm dessus pour pouvoir homogénéiser et l’ont dispose la
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cuve dans la machine afin de suivre l’absorption à 400 nm en fonction dutemps pendant 4
minutes.
Les solutions :
Solutions V sol. Mère
BAPNA [mL] V DMSO [mL] pipettes
utilisées
A 0.25 4.75 1 mL
B 0.50 4.50 1 mL
C 0.75 4.25 1 mL
D 1.00 4.00 1 mL
E 1.25 3.75 2 mL
F 1.75 3.25 2 mL
G 3.50 1.50 2 mL
mère 5.00 0.00 5 mL
NB : à savoir que la solution « mère» est de 0.06M et a été préparée à l’avance.
Les erreurs sur les instruments de mesure de quantités sontles suivantes :
Instruments ∆V (mL)
pipette de 1 mL 0.01
pipette de 2 mL 0.02
pipette de 5 mL 0.02
seringue 0.01
fioles 5 mL 0.08
pipette de 2,5
mL 0.02
L’absorbance par minute a donc été mesurées pour les 8 solutions :
Solutions [BAPNA]
(mol/l)
Pente
(Abs/min)
A 0.003 0.0406
B 0.006 0.0771
C 0.009 0.1072
D 0.012 0.1326
E 0.015 0.1591
F 0.021 0.1958
G 0.042 0.2944
mère...
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