Dosage de proteine

Pages: 14 (3469 mots) Publié le: 28 octobre 2013
INTRODUCTION :

L’objectif de ce TP est d’étudier la mobilité de différents types de protéines sur des gels de migration afin d’en déduire leur poids moléculaire PM, leur structure ou leur identité. 
Trois familles de protéines vont être utilisées : des lisoenzymes de la lactacte déshydrogénase (isoLDH), de l’albumine sérique de bovin (BSA) et une protéine inconnue Y à déterminer.
Unepremière manipulation consistera à faire migrer par électrophorèse, de la BSA, des isoLDH, des protéines inconnues Y et un marqueur de taille, tous monomères, sur un gel de migration dénaturant SDS.
La deuxième manipulation consistera quant à elle à faire migrer, toujours par électrophorèse, des isoLDH et de la BSA natives sous forme de polymères sur des gels de migration non dénaturants ND àdifférents pourcentages d’acrylamide.
Après révélation des gels, l’analyse des résultats permettront de déterminer les éléments recherchés par les mesures des migrations observées et des calculs issus de ces mesures. On obtiendra ainsi, grâce au gel SDS, les migrations relatives RM et les poids moléculaires PM de la BSA de l’isoLDH, et de la protéine Y dénaturés monomères, et grâce aux gels ND, les RM etles PM de la BSA et de l’isoLDH non dénaturés polymérisés. Ces données recueillies permettront par la suite de déterminer l’identité de la protéine Y ainsi que la structure polymérique des isoLDH étudiées.

Matériels et méthode

Lors de ce TP, il est nécessaire d'avoir:
- Appareils à électrophorèse et générateurs - Micropipettes et cônes
- Centrifugeur - Bain-marie à 90°C
- Gants -Béchers, boites de pétri
- Seringues de 10mL - Tubes Eppendorf
- Solutions et tampons (à garder dans la glace pour éviter leur dénaturation)

Solutions pour la préparation des gels:

Acrylamide: Le gel de polyacrylamide permet de séparer des protéines selon leur poids moléculaire PM. La matrice est créée par la copolymérisation d’acrylamide et de bis-acrylamide. Le TEMED et le persulfated’ammonium sont les catalyseurs de réaction, en fournissant des radicaux libres qui vont initier la polymérisation. La grosseur des mailles du réseau formé diffère en fonction de la concentration d’acrylamide. Plus la concentration est élevée, plus les mailles seront serrées et les molécules migrant le mieux seront celles avec le plus faible poids moléculaire.
TEMED: Catalyseur de laréaction de polymerisation des monomères d'acrylamide.
Tampon tris HCL: Il a pour rôle de tamponner le tampon de charge dans le gel SDS.
APS: Initiateur de la réaction de polymérisation de monomère d'acrylamide
SDS (sodium dodécylsulfate): Détergent anionique intégré dans le gel SDS pour dénaturer la protéine en se liant à elle (environ1 molécule de SDS pour 2 acides aminés). Le SDS est undétergent fort possédant une longue chaîne hydrocarbonée hydrophobe et une extrémité chargée négativement. Il interagit avec les protéines par sa portion hydrocarbonée en liant leurs régions hydrophobes. En se liant à la protéine, le SDS empêche son repliement et lui confère une charge nette négative. Cela signifie que seul le poids moléculaire des protéines sera le facteur de leur migration etséparation dans le gel SDS puisque les charges seront les mêmes et n'interviendront donc pas. (Les protéines ayant un poids moléculaire plus faible migreront plus rapidement).
Ferricyanure de potassium FeCNK: Composé permettant de faire apparaitre les protéines en fluorescence lors de la révélation des gels ND.

Echantillons à déposer dans les puits:

BSA (Albumine sérique de bovin):Macromolécule peptidique qui est constituée de protéines simples formées de carbone, hydrogène et oxygène. Le pHi de la BSA dénaturée et non dénaturée est le même mais le PM est de 248kDa pour la BSA native et de 62kDa pour la BSA dénaturée.
isoLDH (Isoenzyme de la lactate déshydrogénase): Enzyme catalysant le lactate en pyruvate. Elle est présente chez de nombreux organismes. Le PM de la...
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