INTRODUCTION :

L’objectif de ce TP est d’étudier la mobilité de différents types de protéines sur des gels de migration afin d’en déduire leur poids moléculaire PM, leur structure ou leur identité.
Trois familles de protéines vont être utilisées : des lisoenzymes de la lactacte déshydrogénase (isoLDH), de l’albumine sérique de bovin (BSA) et une protéine inconnue Y à déterminer.
Une première manipulation consistera à faire migrer par électrophorèse, de la BSA, des isoLDH, des protéines inconnues Y et un marqueur de taille, tous monomères, sur un gel de migration dénaturant SDS.
La deuxième manipulation consistera quant à elle à faire migrer, toujours par électrophorèse, des isoLDH et de la BSA natives sous forme de polymères sur des gels de migration non dénaturants ND à différents pourcentages d’acrylamide.
Après révélation des gels, l’analyse des résultats permettront de déterminer les éléments recherchés par les mesures des migrations observées et des calculs issus de ces mesures. On obtiendra ainsi, grâce au gel SDS, les migrations relatives RM et les poids moléculaires PM de la BSA de l’isoLDH, et de la protéine Y dénaturés monomères, et grâce aux gels ND, les RM et les PM de la BSA et de l’isoLDH non dénaturés polymérisés. Ces données recueillies permettront par la suite de déterminer l’identité de la protéine Y ainsi que la structure polymérique des isoLDH étudiées.

Matériels et méthode

Lors de ce TP, il est nécessaire d'avoir:
- Appareils à électrophorèse et générateurs - Micropipettes et cônes
- Centrifugeur - Bain-marie à 90°C
- Gants - Béchers, boites de pétri
- Seringues de 10mL - Tubes Eppendorf
- Solutions et tampons (à garder dans la glace pour éviter leur dénaturation) Solutions pour la préparation des gels:

Acrylamide: Le gel de polyacrylamide permet de séparer des protéines selon leur poids moléculaire PM. La matrice est créée par la copolymérisation d’acrylamide et de bis-acrylamide. Le TEMED et le