Etude expérimentale de la phosphatase alcaline

3426 mots 14 pages
Etude expérimentale de la phosphatase alcaline

I. BUT :
Etude cinétique de l’activité enzymatique d’une enzyme la phosphatase alcaline .On procède à :
 Une étude cinétique de la libération des produits de la réaction.
 Etude de l’influence de la concentration de substrat(PNPP) sur la vitesse de la réaction.
 Etude d’un phénomène de compétition entre deux substrats.
II. PRINCIPE :
 L’ étude cinétique de la libération des produits de la réaction. La phosphatase alcaline est dosée en suivant, en fonction du temps, l’apparition des produits de la réaction : L a phosphatase alcaline (PH optimum 9-10) est présente dans les os, les reins, le foie et l’intestin. Elle agit sur les esters phosphoriques avec libération du phosphate minéral :

Le p-nitrophényl phosphate est utilisé comme substrat le p-nitrophénol libéré par l’hydrolyse enzymatique est mesuré colorimetriquement .En solution alcaline, le p-nitrophénol absorbe la lumière à 410 nm .Le substrat p-nitrophényl phosphate n’absorbe pas la lumière à cette longueur d’onde et la réaction peut donc être facilement suivi par la mesure de la variation de l’absorbance à 410 nm. Par assistance informatique liée au système de mesure d’absorbance on obtient les valeurs des pentes (en ∆ Do /min) qui nous renseigne sur la vitesse initiale de la réaction qui est mesurée pour des concentrations différentes en PNPP à PH 8,9.
On en déduit :
Vi : la vitesse initiale qui est la vitesse de la réaction enzymatique calculé pendant l’état stationnaire l’état où la concentration en substrat est encore en grand excès par rapport à celle de l’enzyme ce qui maintient constante la concentration du complexe (ES) ,Vi est constante Vi=K2 [ES] car on peut écrire la réaction enzymatique sous la forme générale : E+S ES E+P
Vi augmente quand la concentration en enzyme augmente (pour concentration en substrat constante) et

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