Etude expérimentale de la phosphatase alcaline
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Etude expérimentale de la phosphatase alcalineI. BUT :
Etude cinétique de l’activité enzymatique d’une enzyme la phosphatase alcaline .On procède à :
Une étude cinétique de la libération des produits de la réaction.
Etude de l’influence de la concentration de substrat(PNPP) sur la vitesse de la réaction.
Etude d’un phénomène de compétition entre deux substrats.
II. PRINCIPE :
L’ étude cinétique de la libération des produits de la réaction. La phosphatase alcaline est dosée en suivant, en fonction du temps, l’apparition des produits de la réaction : L a phosphatase alcaline (PH optimum 9-10) est présente dans les os, les reins, le foie et l’intestin. Elle agit sur les esters phosphoriques avec libération du phosphate minéral :
Le p-nitrophényl phosphate est utilisé comme substrat le p-nitrophénol libéré par l’hydrolyse enzymatique est mesuré colorimetriquement .En solution alcaline, le p-nitrophénol absorbe la lumière à 410 nm .Le substrat p-nitrophényl phosphate n’absorbe pas la lumière à cette longueur d’onde et la réaction peut donc être facilement suivi par la mesure de la variation de l’absorbance à 410 nm. Par assistance informatique liée au système de mesure d’absorbance on obtient les valeurs des pentes (en ∆ Do /min) qui nous renseigne sur la vitesse initiale de la réaction qui est mesurée pour des concentrations différentes en PNPP à PH 8,9.
On en déduit :
Vi : la vitesse initiale qui est la vitesse de la réaction enzymatique calculé pendant l’état stationnaire l’état où la concentration en substrat est encore en grand excès par rapport à celle de l’enzyme ce qui maintient constante la concentration du complexe (ES) ,Vi est constante Vi=K2 [ES] car on peut écrire la réaction enzymatique sous la forme générale : E+S ES E+P
Vi augmente quand la concentration en enzyme augmente (pour concentration en substrat constante) et