Hybridation in situ

Pages: 8 (2193 mots) Publié le: 4 mai 2015
Hybridation moléculaire ‘‘in situ’’
Plan :

I – Qu’est-ce que l’hybridation in situ ?
A - Principe général
B - Nature des Sondes
C - Marquage des sondes
D - Mode opératoire
II – Hybridation in situ en Embryologie
A - Son Utilité en embryologie
B - Exemple chez la Drosphila melanogaster

La première hybridation in situ a été réalisée pour la première fois en 1969 par Joe Gal et
Mary-Lou Pardue. Cefut le commencement de la cytogénétique moléculaire. L’utilisation de
celle-ci été considérablement développée dans les années 1980.

I - Qu’est-ce que l’hybridation in situ ?
A - Principe général
L’hybridation in situ est une technique consistant à localiser une
séquence nucléotidique connue au sein des cellules d’une coupe
histologique ou d’un organisme entier. Cette séquence peut être de
l’ADNou de l’ARN. Le principe de cette technique repose sur la
capacité que possèdent deux chaines d’acides nucléiques
complémentaires à s’hybrider pour former une double hélice et ce
grâce à la complémentarité des bases azotées (Adénine avec Thymine
(ou Uracile) et Cytosine avec Guanine).
Ainsi, pour pouvoir localiser une molécule d'ADN ou ARN, on doit choisir une sonde
complémentaire de la séquencecible, c’est-à-dire une séquence nucléotide complémentaire de
la séquence du gène.
Pour l’ADN, composée de deux brins hybridés en double hélice, il faut préalablement la
chauffer (Température de fusion) pour séparer les deux brins afin que la sonde puisse
s’hybrider sur l’un d’entre eux. En revanche, l’hybridation de la sonde avec l’ARN, ne
nécessite pas de préparation préalable puisque l’ARN estmonocaténaire. Cette température de
fusion est essentielle en ce qui concerne l’ADN et se calcule en fonction du nombre de G-C et
de A-T mais également en fonction de la longueur de la chaine nucléotidique.
La nature de la sonde peut être différente en fonction du site d’hybridation.

1

B - Nature des sondes
Nature de la sonde

ADNc double brin

Origine de
fabrication

Obtenu par clonage dansun
plasmide et amplifié par PCR

- Forte stabilité
Avantage
- Obtenu en grande quantité

ADNc monocaténaires
Obtenu par clonage dans un
plasmide et amplifié par PCR
asymétrique
- Forte Stabilité
- Ne nécessite pas de dénaturation
- Pas d’hybridation inter-sonde
- Marquage lors de la synthèse par
PCR

Inconvénients

- Nécessité de la dénaturer avant
son utilisation
- Possibilité de ré hybridationsur
elle-même
- séquence longue (prétraitements,
Tm élevée)

Cible

ADN ou ARNm

ADN ou ARNm

Nature de la sonde

ARN

Oligonucléotides

Origine de
fabrication

Avantage

Inconvénients

Cible

ADN cloné dans un plasmide
Contenant deux promoteurs viraux
d’ARN polymérases

- Obtenu en grande quantité
- Marquage au cours de la synthèse
- Sondes très marquées
- Sens + Anti-sens
- Hybridation très stable(ARNARN)

- Hybridation à haute température
- Grande taille de la sonde
(pénétration difficile)
- sensible aux Rnases : préparation
et stockage plus délicats
ARNm

ADN monocaténaires de synthèse
dont la séquence est
complémentaire de l’acide
nucléique cible. (banques :
EMBL,…)
- Forte Stabilité
- Très spécifique
- Facilité d’utilisation
- Pas d’association possible entre
les molécules de sondes
-Peu onéreux
- Marquage lors de la synthèse par
PCR
- Sondes peu marquées
- Détermination de la température
d’hybridation délicate
- La séquence choisie peut être
difficile d’accès
ADN ou ARNm

2

Spécificité de la sonde :
La sonde doit s’hybrider avec une séquence précise qu’il faut préalablement bien choisir
(séquence codante ou non, introns/exons,…)
La taille de la sonde doit être égalementchoisie, assez longue
pour assurer une bonne stabilité et assez courte pour qu’il y ait
une bonne pénétration dans les tissus.
L’hybridation avec l’ARNm est difficile car il faut connaître
la structure de l’ARNm mature. En effet, le transcrit primaire
contient les introns.
C - Marquage de la sonde
Afin de localiser où se produit l’hybridation, il faut marquer la sonde. Ce marquage diffère en...
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